基因治疗的应用及研究进展

文章编号：１００９－０００２（２００７）０４－０６７７－０３

生物技术通讯

６７７

综述

基因治疗的应用及研究进展

张峰１，２，霍金龙１，２，曾养志１，２

１．云南省版纳微型猪近交系重点实验室，云南昆明６５０２１２；２．云南农业大学动物科学学院，云南昆明６５０２０１

［摘要］

基因治疗是一种新的治疗手段，可用于癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等的治疗。

未癌症基因治疗是基因治疗的主要应用领域。过去几年里，全球基因治疗临床试验取得了很大的进步，也遇到了很多困难。来基因治疗的主要目标是发展安全和高效的基因导入系统，它们能将外源遗传物质靶向性地导入特异的细胞。简要综述了基因治疗研究和应用的进展、困难及其发展前景。［关键词］

基因治疗；体内疗法；体外疗法

［中图分类号］

Ｑ７８９［文献标识码］Ａ

ＲｅｓｅａｒｃｈＡｄｖａｎｃｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｎｔｈｅＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ

ＺＨＡＮＧＦｅｎｇ１，２，ＨＵＯＪｉｎ－ｌｏｎｇ１，２，ＺＥＮＧＹａｎｇ－ｚｈｉ１，２

１．ＢａｎｎａＭｉｎｉ－ｐｉｇＩｎｂｒｅｄＬｉｎｅｓＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＹｕｎｎａＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２１２G２．ＦａｃｕｌｔｙｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２０１LＣｈｉｎａ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］

Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｉｓａｎｅｗｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｉｖｅｒｓｅｔｙｐｅｓｏｆｄｉｓｅａｓｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃａｎｃｅｒ，ｃｏｎ－

ｇｅｎｉｔａｌｇｅｎｅｔｉｃ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ，ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒａｎｄａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｉｓｔｈｅｍａｉｎｓｔｕｄｉｅｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔｈｅｌａｓｔｆｅｗｙｅａｒｓ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｄｖａｎｃｅｓｈａｖｅｂｅｅｎｍａｄｅｉｎｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓａｂｏｕｔｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ．Ｂｕｔｓｏｍｅｐｒｏｂｌｅｍｓｓｔｉｌｌｎｅｅｄｔｏｂｅｓｏｌｖｅｄ．Ｉｎｔｈｅｆｕｔｕｒｅ，ｔｈｅｍａｉｎｏｂｊｅｃｔｉｖｅｉｎｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｉｓｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓａｆｅａｎｄｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍｓｔｈａｔｃａｎｄｅｌｉｖｅｒｆｏｒｅｉｇｎｇｅｎｅｔｉｃｍａｔｅｒｉａｌｓｉｎｔｏｓｐｅｃｉｆｉｃｃｅｌｌｔｙｐｅｓ．ｓｔｕｄｙｉｎｇａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅａｒｅａｏｆｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙａｃｈｉｅｖｅｄｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ，ｐｅｏｐｌｅｈａｖｅｔｏｆａｃｅｉｎｔｈｅｆｕｔｕｒｅｗｅｒｅｐｕｔｆｏｒｗａｒｄｓ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］

Ｔｈｅｍａｉｎ

ａｎｄｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓｉｎｔｈｉｓｆｉｅｌｄｔｈａｔ

ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙLｉｎｖｉｖｏ9ｅｘｖｉｖｏ

１基因治疗概述

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一

２

２．１

基因治疗的应用研究进展

ｐＲＮＡ－纳米技术在分子基因治疗中的应用

ＲＮＡ可以用作从小到大构建纳米体系的材料［５］。ＲＮＡ没有

定方式导入人体靶细胞，以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。

广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗，而通常所称狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗，一般用

结合蛋白质的时候，具有非常低水平的或者不易检测到的免疫原性。因此，利用从小到大的技术组装构建的ＲＮＡ纳米粒子克服了上述问题，这样构建的药物输送系统不含蛋白质或多肽，只有２５ｎｍ，能避免免疫反应，可以在慢性病的治疗中长期给药，具有重现性；同时，它的大小适中，避免了过小分子（＜２０ｎｍ）滞留期短、过大粒子（＞１００ｎｍ）难以输送的缺点。而多样性使ＲＮＡ纳米微粒能够运载多价治疗分子以增强治疗效果，使用一个复合体来执行多个分子的功能，将有助于避免治疗中可能出现的多重不良反应，借以发展一种新的特异治疗策略。研究证明，二聚体产物可以将治疗性ＲＮＡ药物特异性地输送到特定细胞［６］，并可利用ｐＲＮＡ三聚体的形成机制来实现３个成分的共输送。以六聚复合体形式达到６种成分的共输送也是有可能的，因为

ＤＮＡ序列。基因治疗常用方法有２种，即体内疗法（ｉｎｖｉｖｏ）和体

外疗法（ｅｘｖｉｖｏ），主要的治疗途径是体外基因治疗，即在体外用基因转染病人靶细胞，然后将经转染的靶细胞输入病人体内，最终给予病人的疗效物质是基因修饰的细胞，而不是基因药物［１，２］。体内疗法是将外源基因导人受体体内有关的器官组织和细胞内，以达到治疗的目的。这些基因药物可以是完整基因，也可以是基因片段（包括ＤＮＡ或ＲＮＡ）；可以是替代治疗，也可以是抑制性治疗（包括ＤＮＡ转录水平和ｍＲＮＡ翻译水平）。基因药物不但可用于治疗疾病，而且可用于预防疾病。这类基因药物疗法简单易行，发展迅速，新型基因药物也不断产生［３］。基因治疗目前主要用于治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括遗传病（如血恶性肿瘤、心血管友病、囊性纤维病、家族性高胆固醇血症等）、疾病、感染性疾病（如艾滋病、类风湿等）等［４］。

ｐＲＮＡ可形成六聚体［７］。由于六聚体由６个ｐＲＮＡ组成，因此，有

［收稿日期］

［基金项目］［作者简介］［通讯作者］

２００６－１１－０３

国家高技术研究发展计划重点资助项目（２００３ＡＡ２０５００９）张峰（１９８２－），男，硕士研究生

曾养志，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｂｎｗｘｚｊｊｘ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ

６７８

治疗分子、检测分子的位点。六６个可以用来携带细胞识别分子、

聚体ＲＮＡ复合体的第１个单体，可被修饰来连接ＲＮＡ适体（ａｐ－

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．４Ｊｕｌ．，２００７

（ＦＧＦ）和血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）等，使植入的心肌细胞更有利于坏死心肌的修复；２个月后发现移植细胞仍然存活且和受体心肌细胞形成闰盘结构。从此，干细胞的基因治疗被应用于心肌梗死的动物模型中。

生物技术通讯

ｔａｍｅｒ，能结合特异细胞表面受体），由此诱发受体介导的胞吞作

用。第２个单体可以连接荧光染料、重金属、量子点（ｑｕａｎｔｕｍ荧光珠（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｂｅａｄｓ）或放射性同位素，作为检测癌细ｄｏｔｓ）、

胞发育的不同阶段的信号。六聚体的第３个单体可以添加降解内体（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）的化学物，以促进小干扰ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ

Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等［１７］用腺病毒作载体，把人的ＶＥＧＦ１６５转染于Ｌｅｗｉｓ鼠的间充质干细胞（ＭＳＣ）中，然后连同ＭＳＣ注入同源的心

肌梗死１ｈ以后鼠的模型中，并设对照组，１周后在心梗区域可以找到ＭＳＣ，同时检测到实验组的ＶＥＧＦ高表达；２８ｄ后，无论是心梗的范围、左室的容积、射血分数、Ｅ／Ａ和心梗区域毛细血管的密度，实验组都明显优于对照组。同时，通过免疫组化分析，在实验组发现了平滑肌细胞和肌动蛋白阳性细胞。实验证实了干细胞移植联合基因治疗是治疗急性心肌梗死的有效方法。

ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）在输送入核内后从内体的释放，从而增强治疗的效

果。第４个单体可以连接核苷酸衍生物，如２－氟－２－脱氧－ＣＴＰ、

２－氟－２－脱氧－ＵＴＰ或锰铁化合物，以稳定体外的ＲＮＡ转录产

物，防止ＲＮａｓｅ的降解［８］。第５个单体则连接治疗ｓｉＲＮＡ、核酶、反义ＲＮＡ或其他药物。六聚体的第６个单体可以被设计来检测细胞凋亡。这一多价复合物同样可能通过识别被感染细胞表面特有的病毒糖蛋白来治疗慢性病毒感染性疾病，如艾滋病和乙型肝炎。而且，目前已阐明ＲＮＡ通常不诱导可察觉的免疫反应，除非它与蛋白质结合。因此，ＲＮＡ作为药物输送载体的好处是避免了药物长期使用可能引起的免疫反应问题，以及蛋白质载体的排斥问题。而这样一个ＲＮＡ复合物仅２５ｎｍ，因此其在体内滞留时间更长。而且，该ｐＲＮＡ分子的毒性或其他不良反应可通过与小的ＤＮＡ聚合物结合进一步减轻。

Ｓｏｎｇ等［１８］研究发现，ＭＳＣ对损伤的心肌有潜在的修复作用，

但是移植的ＭＳＣ的存活能力低下。为了减少细胞的损失，用ＦＧＦ转染ＭＳＣ作为移植细胞，在体外培养。２周后９５％以上的细胞表达ＣＤ７５，２８％的细胞表达心肌特殊转入因子Ｎｋｘ２．５和α－骨骼肌肌球蛋白ＧＡＴＡ４。然后把ＦＧＦ－２基因转染ＭＳＣ，发现ＦＧＦ的分泌增加，Ｂｃｌ２抗凋亡基因增加，同时ＭＳＣ的成活数量增加３倍。在心梗的区域注射５×１０９的转染ＦＧＦ的ＭＳＣ，可以存活４周，而且象心肌一样表达肌钙蛋白，产生有功能的肾上腺素受体，梗死区域的新生血管也增加。由于转染ＦＧＦ的ＭＳＣ的存活率明显上升，新生血管增加，所以得出ＦＧＦ转染ＭＳＣ有利于心肌梗死和终末期心衰的结论。

２．２以ｓｉＲＮＡ为基础的基因治疗

虽然ｓｉＲＮＡ在哺乳动物细胞中的应用不很广泛，但它正以

飞快地速度发展成为基因治疗的一种新方法。如果ｓｉＲＮＡ通过尾静脉高压注射能有效到达肝脏，那么它将可以广泛用于治疗各种肝病［９］。通过沉默肝中内源性凋亡基因的表达，经抗凋亡酶

３

３．１

基因治疗的一些问题

理想载体的选择

一个理想载体需要有高效的转移率，能将外源基因定向导

Ｃａｓｐａｓｅ－８或抗Ｆａｓ细胞死亡受体的ｓｉＲＮＡ预处理的小鼠能有

效预防各种试剂诱导的急性肝功能衰竭，用同样的ｓｉＲＮＡ也能治疗已经发生的肝损伤。ｓｉＲＮＡ通过抑制病毒自身或者抑制病毒转录所必需的辅助因子，还能达到抗病毒的目的。将乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因组和ｓｉＲＮＡ共转染，可以有效降低ＨＢＶ的复制水平和蛋白合成。Ｗｏｈｌｂｏｌｄ证明，用ｓｉＲＮＡ能有效沉默异常

［１１］

［１０］

入靶细胞，能转导不的细胞，能稳定整合到宿主染色体上。反转录病毒和腺相关病毒（ＡＶＶ）可以整合到宿主基因组，其转导率几乎可达１００％，并可获得持续的表达。反转录病毒载体作为基因转移研究中的基因转移系统有许多优点，是目前基因转移技术中最常用的，也是成功率最高的。但是反转录病毒与其他病毒相比又是不稳定的，纯化和浓缩后的反转录病毒会明显丧失感染能力，这都了反转录病毒在活体内应用的进一步开展。至于腺病毒，在离体情况下可获得高表达，也能维持一段时间，但它的作用机制还不是很清楚，而且它在体内的复制将引发对安全性的考虑。另外，它的重复感染所引起的免疫反应也是必须考虑的问题。不过，腺病毒可以整合到不的细胞中去，而这正是反转录病毒所不能做到的。腺相关病毒的整合效率不及反转录病毒，但最近的研究表明，它可直接注射于患者体内，携带基因产生表达产物治疗疾病。有人把携带有因子Ⅸ基因的腺相关病毒注射到一个患有Ｂ型血友病的病人肌肉中，产生了较好的效果，对它的进一步研究正在进行中。单纯疱疹病毒在中枢神经系统疾病中特别有用，但其复杂的复制特性和很难获得重组病毒的原液，均了其应用前景。由此看来，利用病毒并结合物理方法是构建理想载体的方向。

ＢＣＲ－ＡＢＬ融合基因的表达，而不影响正常ｃ－ＢＣＲ和ｃ－ＡＢＬ的

转录，这为治疗Ｐｈ染色体阳性的慢性粒细胞白血病提供了新方法。在血浆中，ｓｉＲＮＡ双链能抵抗核酸内切酶的降解作用，但这并不意味着其能够稳定地存在于机体内

［１３］

［１２］

，因为未被修饰的

ｓｉＲＮＡ不能迅速进入细胞内，或者与血浆蛋白亲和力低而较早地

被机体清除。如果不是通过表达ｓｉＲＮＡ载体的方法，那么必须经有研过化学修饰的ｓｉＲＮＡ才能更有效地作为基因治疗的手段。究正通过硫磷酰修饰ｓｉＲＮＡ提高细胞的摄取能力，从而增强基因沉默的效果［１５］。２００５年美国食品药品管理局（ＦＤＡ）已批准经过修饰的ｓｉＲＮＡ进行临床新药试验，用于治疗与年龄相关的黄斑退行性改变（ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）的患者。最近，

［１４］

Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ经鼠尾静脉注射胆固醇修饰的抗ａｐｏＢｓｉＲＮＡ，能有效

沉默同源性靶基因的过度表达，并且证实经修饰的抗ａｐｏＢｓｉＲ－

ＮＡ导致小鼠胆固醇水平降低的程度与ａｐｏＢ基因敲除小鼠的水

平相近，这实现了ｓｉＲＮＡ作为静脉注射性治疗药物的可能。

２．３干细胞应用于基因治疗的研究进展

１９９４年Ｓｎｏｏｐａａ等［１６］报道，胚胎心肌细胞植入正常心脏后可

长期存活。给植入的细胞转染了融合基因α－肌球蛋白重链基因启动子和β－半乳糖苷酶报告基因，心肌细胞可表达许多对心肌有益的产物，如转化生长因子（ＴＧＦ）、成纤维细胞生长因子

３．２细胞的选择

由于病毒载体的各个特定序列往往与特异的细胞因子结

合，因而靶细胞类型直接决定载体的表达效率及存在状态。不过，该过程的详细机制至今仍未阐明。骨髓细胞是最被重视和最

张峰等：基因治疗的应用及研究进展

常用的靶细胞，这是由于骨髓移植（ＢＭＴ）有如下优点：①骨髓组织易于接受各种处理；②多年来应用身体或异体ＢＭＴ治疗血液病和恶性肿瘤已累积了丰富的经验；③许多已知的遗传病都或多或少涉及到源自骨髓的细胞；④源自骨髓的细胞（如血细胞、组织巨噬细胞等）遍布全身，几乎存在于所有的器官和组织中，因而有可能应用经基因工程改造过的骨髓细胞来治疗一些并不直接与骨髓细胞有关的遗传病。但骨髓细胞作为基因治疗的靶细胞，也有一些缺点：①必须用基因工程改造骨髓干细胞，才能得到稳定的持久的治疗效果，但干细胞含量很少，仅占骨髓细胞的０．１％左右；②治疗基因在用核骨髓细胞中的表达时间太短，不超过几个月，对于人的基因治疗来说实在太短了；③只有部分干细胞具有活性，因而治疗基因是否有效取决于是否大部分活性干细胞含有该基因；④骨髓造血干细胞的分化可能导致基因的失活；⑤有的遗传性疾病与骨髓细胞完全无关。

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究，而体内外环境差别很大，但科学从不会放弃任何有希望而又有效的非病毒载体，还需要漫有可能的尝试，要开发出更安全、

长的理论创新和技术突破，这并不妨碍人们对它们成为理想的基因治疗载体寄予厚望。

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３．３目的基因的高效表达

经过多年的发展，人们已经发现了多种基因表达载体及有

效的基因转移途径，但高效的表达问题一直困扰着大家。基因的转录有效高效表达是一个非常复杂的问题，它受ＤＮＡ拷贝数、

翻译有效性，以及蛋白质加工、性、ｍＲＮＡ的加工转移和稳定性、分泌及稳定性等因素的影响，而且不同基因高效表达的限速因素又不一致。因此，提高目的基因表达的手段不仅限于表达载体调节成分的设计，人工改造基因使之协调于调节顺序及宿主细胞也是一个重要的趋势。

４基因治疗的应用前景

高效表达载体和适用于临床的基因转移方法是决定基因治

疗成功的基础，在体内精密目的基因的表达是决定基因治疗成功的关键，基因治疗的安全性是决定基因治疗成功的保证。基因治疗的发展已取得了巨大成就，它已被看成是对先天和后天基因疾病的潜在的、有效的治疗方法，不过它依然存在缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达及宿主产生免疫反应等问题。今后基因治疗研究将向２个方向发展：其一是基础研究更加深入，以解决在临床应用中遇到的一些困难及基因治疗本身需可控性弱、目的基因少等）为主要解决的一些难点（如靶向性差、

要研究内容；其二是临床项目增多，实施方案更加优化，判断标准更加客观，评价效果更加精确。成功的基因治疗应以安全、有效、简便、实用为目的。随着人类基因组计划的顺利实施和完成，以及新的人类疾病基因的发现和克隆，基因治疗研究和应用将不断取得突破性进展。

从理论上看，基因治疗的着眼点必须从整体的系统观点出整体与外部环境的相互联系、相互发，始终着眼于局部与整体、

作用、相互制约的关系［１９］。基因治疗最终要落脚于人类疾病的治疗，但基因治疗是一种新技术，在理论和技术方面尚有一些关键问题急须发现和解决。有人提出，为了最大限度地保护病人，基因治疗应采用“优后原则”，即当其他传统疗法无效或微效时，再使用基因治疗，安全性是基因治疗首要解决的问题。开发一种能高效转移基因、表达高度组织特异性、能进行精确控制表达的理想载体是关键的突破口。目前病毒载体由于插入后不稳定因素太多，虽然表达较稳定，但终究要逐渐被方兴未艾的非病毒载体所取代。虽然对各种新载体的研究尚不健全，且大部分是体外研