免疫与肿瘤

在肿瘤发生与发展的过程中，机体免疫系统起重要作用，一方面，免疫系统对肿瘤细胞监视与清除作用，对预防肿瘤发生及发展起重要作用；另一方面，随着肿瘤的发展及多种因素作用下，免疫系统对肿瘤细胞清除作用降低，近年来，伴随着分子生物学、生物工程、免疫学基础理论的发展，肿瘤免疫学已成为最活跃的生命科学研究领域之一，其中揭示了人类肿瘤抗原，丰富了肿瘤抗原加工、呈递和识别的基础知识；T细胞、NK细胞、树突细胞的研究有了重要进展；细胞过继免疫治疗、细胞因子治疗、肿瘤疫苗的临床研究持续稳定发展。这些免疫疗法已显示出与传统常规手术、放疗、化疗3大疗法的互补性，能减少术后复发、转移，减轻化疗、放疗的不良反应，是一项具有巨大治疗潜力的疗法。出现对肿瘤细胞的免疫耐受，甚至在一定程度上促进肿瘤生长及转移。本篇首先阐述免疫系统对肿瘤细胞的清除机制以及免疫系统如何被肿瘤细胞“招安”的机制。其次，总结近年免疫治疗肿瘤的策略及方法的主要进展。

一 免疫系统对肿瘤细胞的监视与清除

（一）参与肿瘤监视与清除的细胞及因子 1.树突状细胞（dentritic cell,DC）

树突状细胞广泛分布于全身组织和脏器，数量较少，仅占人外周血单个核细胞的1%，因具有许多分枝状突起而得名。DC根据来源可分为髓系树突状细胞（myeloid DC）和淋巴系树突状细胞（lymqhoid DC）。DC细胞为专职抗原提成细胞，其主要功能为摄取、加工和提成抗原，从而启动适应性免疫应答。未成熟DC高表达lgG Fc受体，C3b受体、甘露糖受体和某些Toll样受体；低表达MHCI、MHCⅡ类分子。成熟DC表面表达CD1a、CD11c、CD83，并高表达MHCI、MHCⅡ分子及B7、ICAM等，其摄取、加工抗原能力弱，而提呈抗原能力强。DC是唯一能够诱导初始T细胞（naïve T）活化的抗原提呈细胞，是适应性免疫应答的始动细胞。

2.T淋巴细胞

成熟T细胞表型主要为CD3＋、CD2＋、CD4＋（或CD8＋）、TCRαβ＋。初始T细胞完全活化需要两种信号协同作用。一种由TCR识别抗原产生，经CD3将信号传入细胞内；另外一种称为协同刺激信号，由APC （antigen presenting cell）或靶细胞表面协同刺激分子与T细胞表面相应受体相互作用而产生。主要有CD28与-4,配体为B7,表达于专职APC细胞，但CTLA-4与B7结合产生抑制信号。

3.自然杀伤细胞（natural killer, NK）

NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育以来与骨髓或胸腺微环境，主要分布于外周血和脾脏，在淋巴结核其他组织中也有少量存在。占外周血淋巴细胞10-15%，含有高浓度溶细胞酶。NK细胞不表达特异性性抗原识别受体，是不同于T、B淋巴细胞的第三类淋巴细胞。NK细胞目前标志为TCR―、mIg― CD56＋ CD16＋。NK细胞表面也表达lgG Fc受体，因此也可以借助ADCC作用杀伤靶细胞。NK细胞可以被INF-α、INF-β、IL-2、IL-12、IL-15、 IL-18等细

胞因子激活，活化的NK细胞分泌INF-γ、IL-2、和TNF, 从而进一步增强NK细胞非特异性杀伤靶细胞的作用。

（二）免疫系统抗肿瘤机制

免疫系统上上肿瘤细胞主要通过两个途径。及CTL细胞杀伤途径和NK细胞杀伤途径。

1.CTL细胞杀伤途径

CTL细胞杀伤途径分为肿瘤抗原提呈，CTL细胞杀伤及肿瘤细胞溶解或凋亡三个过程。肿瘤抗原提呈：肿瘤分泌产物及肿瘤细胞被APC细胞（主要为DC细胞）吞噬，加工处理成肿瘤相关抗原（tumor associated antige; TAA）肽，与MHC-I类分子形成复合物表达于APC细胞表面, TAA包括新生抗原病毒基因、变异基因表达产物；自身抗原包括细胞扩增、分化或去分化过多表达的分子以及异常表达的胚胎抗原等。肿瘤相关抗原肽MHC-I复合物通过与TCR结合被特异

＋

性 CD8细胞识别。同时在协同刺激分子CD28-B7复合物作用下活化、增殖,分化为细胞毒性淋巴细胞（cytotoxic T cells CTL）。同时活化CD8＋T淋巴细胞分泌TNF-α、INF-γ、IL-2等细胞因子。

CTL通过MHC-I肿瘤抗原复合物结合肿瘤细胞，并通过两种途径杀伤肿瘤细胞，一种为CTL细胞与肿瘤细胞在TCR-MHC-I抗原复合物结合前提下，CTL膜表面Fas蛋白与肿瘤细胞Fas配体（CD95）结合，启动经典caspase级联反应，诱导肿瘤细胞凋亡。另外一种途径为CTL细胞与肿瘤细胞在TCR-MHC-I抗原复合物结合前提下，CTL释放穿孔素及溶细胞酶，直接杀死肿瘤细胞或诱导细胞凋亡。在CTL清除肿瘤细胞过程中，CTL分泌的INF-γ、TNF-α等细胞因子起重要作用。TNF-α与肿瘤细胞受体结合可以直接导致细胞启动经典caspase级联反应，诱导肿瘤细胞凋亡。INF-γ与肿瘤细胞结合，可以增加MHC-I抗原复合物表达及促进Fas-Fas配体诱导的肿瘤细胞凋亡。

2.NK 细胞杀伤肿瘤细胞途径

成熟NK细胞表面表达细胞毒受体（NKp30,NKp44; NKp46）,Fc受体NK2GD及CD16，MHC-I受体KIRs(killer cell Ig-like receptors)以及非经典MHC-I受体NK2GA/CD94。当NK细胞在循环中或组织中遇上异常或阴性MHC-I表达的肿瘤细胞时，正常细胞普遍存在MHC-I分子。NK细胞通过NK2GA/CD94与，与MHC-I类分子结合，稳定细胞内酪氨酸磷酸蛋白激酶。从而稳定NK细胞，当NK细胞与MHC-I阴性或低表达的肿瘤细胞结合并释放穿孔素及溶细胞酶，从而杀死肿瘤细胞。另外NK细胞也可以通过NK2GD及CD16通过ADCC机制杀灭肿瘤细胞。因此，功能完整NK细胞在预防肿瘤转移中起重要作用。

在NK细胞发挥杀伤肿瘤细胞过程中，DC细胞也起到非常重要的作用：实验表明DC细胞与休眠NK细胞体外共培养可以增加NK细胞的细胞毒作用及INF-γ的分泌。进一步研究表明，DC细胞在细胞直接对话基础上通过分泌IL-12/IL-18或IL-2NK细胞的细胞毒作用及INF-γ的分泌。另外髓系DC细胞通过分泌IL-15促进NK细胞增殖。而NK细胞通过INF-γ及TNF-α促进DC细胞成熟，此过程中，NK细胞表面NKp30受体起重要作用，同期，未成熟DC细胞在NK细胞作用下发生凋亡。

二 肿瘤细胞对免疫系统耐受机制

在肿瘤发生发展过程中，免疫系统通过多种途径对肿瘤杀伤，清除。但多数恶性肿瘤细胞仍然能够快速增值并发生转移。并且在临床上也发现肿瘤患者免疫

低下状态。目前研究表明肿瘤免疫耐受及免疫逃逸机制包括：1.肿瘤细胞可以通过减少或异常表达HLA-I类（human leukocyte antigen class I）分子逃避CTL细胞或NK细胞杀伤作用。2.肿瘤细胞表达FasL蛋白对T淋巴细胞杀伤作用。3.Treg细胞增殖对免疫系统抑制作用增强等。

（一）肿瘤人类白细胞抗原I类分子表达减少或异常表达

HLA-I类分子在CTL细胞上上肿瘤细胞过程中起重要作用，HLA-I类分子如果HLA-I类分子表达缺失无疑会导致肿瘤细胞免疫逃逸成功。有临床研究表明正常表达HLA-I类分子的膀胱癌患者较HLA-I类分子表达低下的患者生存期明显延长。对头颈部和肾癌研究表明正常表达HLA-I类分子肿瘤组织中有更多CD8＋T淋巴细胞。表1列举了近年来部分肿瘤细胞HLA-I类分子表达与患者病情发展的相关关系。

HLA-I类分子异常表达不但是肿瘤细胞对CD8＋T淋巴细胞产生抵抗作用，可能也是肿瘤细胞对NK细胞杀伤作用抵抗的重要原因。有推测认为可能肿瘤细胞在CTL及NK细胞双重压力选择下，肿瘤细胞HLA-I类分子表达处在一个微妙的平衡。HLA-G一般在胎盘滋养层细胞，正常情况下与抑制性受体inhibitory receptors Ig- like transcript (ILT) 2, ILT4 或 KIR2DL4结合，可以抑制CD8＋T淋巴细胞及NK细胞。对不同种系肿瘤细胞研究发现30-90%肿瘤细胞表达HLA-G。

肿瘤细胞染色体6p21杂合体突变可以造成HLA-I类分子表达缺失。结肠癌与黑色素瘤研究发现β2微球蛋白突变导致HLA-I类分子不能转运至细胞膜表面，受损转运系统元件还包括TAP1 and TAP2等。

表1 部分肿瘤细胞HLA-I类分子表达与患者病情发展的相关关系

HLA-I类分子肿瘤组织HLA-I类分子阴性表达情况与患者病情

肿瘤部位

抗体 发展的相关关系

A-072和 GRH1 HLA-I类分子完全阴性表达与恶性程度及复发相关 膀胱癌 A-072 5年生存期：HLA-I阳性：74%；HLA-I阴性：34% 胃癌 A-072 T1期100%阳性表达；T2-T3期100%阴性表达

乳腺癌 HC-10 低度恶性阴性表达：0%，高度恶性患者：67.7% 胰腺癌 W6/32 and 246-E8.E7 原发灶患者阴性表达：6%，转移性病灶患者：43% 前列腺癌 A-072 良性患者阴性表达：0%，原发病灶：41%，淋巴结转移67%

注：W6/32 为检测HLA class I antigen (HLA-ABC)单克隆抗体; 246-E8.E7, HC-10 and GRH1 为抗β2-m 单克隆抗体; rA-270为兔抗β2-m 多克隆抗体 (DAKO).

（二）肿瘤细胞凋亡通路异常促免疫细胞凋亡

CTL杀伤肿瘤细胞依赖于肿瘤细胞内正常caspase级联反应，caspase级联反应异常引起肿瘤凋亡异常，导致显著肿瘤细胞对CTL杀伤耐受。例如：c-FLIP为抗凋亡调节蛋白FLICE抑制蛋白，其表达增加与TRAIL通路诱导凋亡显著相关，在恶性黑色素瘤细胞表达与增高。P53基因异常与ras异常可导致Fas蛋白/CD95转录水平异常。多发性骨髓瘤，乳腺癌、胃癌均发现CD95/FAS, TRAILR1, R2细胞内片段缺失，从而引起凋亡异常。

一般细胞均表达Fas蛋白，对于免疫系统，例如未成熟CTL细胞，可以在体内CTL细胞增殖过多时其膜表面Fas蛋白与成熟CTL表面FasL结合，启动AICD（T-cell activation-induced cell death ）促使部分未成熟T淋巴细胞凋亡。一方面，CTL与肿瘤细胞膜表面Fas蛋白结合促进肿瘤细胞凋亡，另一方面肿瘤细胞也可

以表达FasL与CTL膜表面Fas蛋白引起肿瘤内CD8＋TIC（tumor-infiltrating immune cell）凋亡。已经在多种肿瘤细胞发现FasL过多表达。临床已经证实结肠癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌以及鼻咽癌等肿瘤组织FasL阳性表达与肿瘤恶性程度、转移明显

＋

相关。另外肿瘤活检标本也证实肿瘤组织FasL阳性表达与肿瘤内CD8TIC数量成反比及与TIC凋亡成正比。

（三）肿瘤表达产物对活化T淋巴细胞抑制作用

正常淋巴细胞表面存在抑制性受体，包括CTLA-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4）和PD1（programmed death-1”),活化T淋巴细胞抑制性受体表达上调，与DC细胞表面B7分子家族结合产生抑制作用。CTLA-4与CD80（B7.2）结合磷酸化酶2A，磷酸化酶2A使Akt激酶去磷酸化，从而阻止TCR/CD28信号传导通路。 PD1/B7-H1复合物通过酪氨酸激酶途径抑制磷酸肌醇激酶3阻断TCR/CD28信号传导通路。 多种肿瘤细胞表达B7家族蛋白，研究表明肿瘤细胞B7家族蛋白阳性表达与食管癌、卵巢癌、泌尿系肿瘤较差预后相关。

另外 TGF-β在抑制T淋巴细胞功能方面起重要作用。无数临床研究肿瘤组织内 TGF-β1表达与肿瘤侵袭性及转移相关。病理组织发现TGF-β1表达与肿瘤内TIC负相关。但TGF-β1抑制活化淋巴细胞机制目前尚不十分清楚。TGF-β1可能抑制TCR以及IL-2相关诱导酶成分表达，从而进一步干扰T淋巴细胞信号传导。

其他肿瘤对肿瘤组织内免疫细胞的表达产物目前还包括环氧合酶-2（cyclooxygenase,COX-2）、半乳凝素（galectin），COX-2产物PEG2减少Th1淋巴细胞数量，增加Th2数量，并且诱导CD4+淋巴细胞FoxP3表达。进一步抑制免疫监视功能。半乳凝素在恶性黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌等肿瘤细胞高表达，与肿瘤转移明显相关，并直接可以导致T淋巴细胞凋亡。但具体过程目前并不十分清楚。

（四）Treg细胞、MDSC、DC细胞功能翻转

Treg细胞（Regulatory T Lymphocytes）为具有免疫抑制功能的T淋巴细胞。Treg细胞表面标志物包括CD4+、CD25+、CD127+、FoxP3+、CTLA-4 、GITR (gluco corticoid-induced TNF receptor)。

Treg细胞对肿瘤免疫耐受重要依据首先为多数肿瘤组织高CD4+、CD25+淋巴细胞浸润与肿瘤患者预后不良相关。这些肿瘤组织存在对Treg细胞聚集作用，可能是通过肿瘤细胞或肿瘤组织内巨噬细胞分泌的CCL22因子对Treg细胞化学趋化作用有关。另外，DC细胞在Treg细胞增殖、分化过程中起重要作用。DC细胞起源，成熟过程中信号刺激及是否与有足够的T淋巴细胞与功能关系极为密切。类浆细胞源性（plasmacytoid， pCD）与髓源性CD细胞可以诱导FoxP3+ Treg细胞分化增殖，在此过程中，IDO（indoleamine 2,3-dioxygenase 哚吲胺双氧合酶)、TGF-β 起关键作用。

肿瘤发展过程中，产生一系列作用移植DC细胞成熟及抗原提呈功能，TGF-β、 IL-10、 IL-6、 VEGF、 IDO与 PGE2均为重要的细胞因子。更为重要的是，将成熟DC细胞与部分免疫抗原比如LPS单独培养，成熟DC细胞分化成为“衰竭型”DC细胞并分泌IL-10而不是IL-2，诱导的不是CTL效应，而是促Th2细胞活化效应。因此，在肿瘤细胞“编辑”作用下，DC细胞不但失去抗原提呈功能，进一步促进肿瘤的免疫耐受。

另外一种肿瘤相关免疫抑制细胞为MDSCs（myeloid-derived suppressor cells），其免疫学标志为CD11c+, CD11b+, CD33+, CD34+ 和CD15+。MDSCs可以直

接通过ARG(arginine-metabolic enzyme I)I和ARGII抑制CD8+ T-淋巴细胞与NK细胞。

三 肿瘤的免疫治疗

免疫系统对肿瘤细胞的“失能”是肿瘤细胞能够浸润生长与远处转移的重要原因。针对肿瘤细胞对免疫系统的耐受机制，可能为肿瘤治疗开辟新的治疗途径，目前，已经有一些针对肿瘤的免疫治疗取得一定临床疗效。另外有一些针对肿瘤免疫耐受的不同正在研究过程中。常见的免疫治疗策略包括免疫细胞因子治疗与细胞免疫治疗。

（一）细胞因子治疗

1.干扰素：干扰素（inferon;INF）最初认为是免疫细胞分泌的具有抗病毒功能的糖蛋白，目前已经确定三的亚型：IFN-α (实际上有一个干扰素家族), IFN-β和IFN-γ，IFN-α与 IFN-β受体为IFNAR-1 与IFNAR-2复合物，临床上使用的干扰素制剂多为IFN-a2b, IFN-a2b抗肿瘤机制可能包括以下几种：1.IFN-α 可以刺激NK细胞成熟，诱导MHC I类分子表达及增强抗体识别。2. IFN-α可以增强CD4+淋巴细胞细胞毒性作用及促进Th1细胞功能。3..IFN-a2b可以诱导TRAIL表达促进TNF相关性肿瘤细胞凋亡。也可以单独通过caspase-8诱导肿瘤细胞凋亡。4. IFN-α可以减少肿瘤微血管增殖；降低基础成纤维细胞生长因子产生，下调基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotease-9 MMP9) mRNA转录及相关转录因子的表达。

目前临床上使用干扰素治疗效果最明显的为慢性粒细胞白血病，长期规范治疗可以使患者血液学.完全缓解率达60-80%，Ph1染色体转阴率达30-45%。其他常用干扰素治疗的肿瘤包括：毛细胞白血病、低度恶性非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、黑色素瘤、类癌及AIDS相关恶性肿瘤。但单用INF对晚期实体肿瘤疗效欠佳，比如，临床试验表明：单独使用INF对结肠癌、非小细胞肺癌及前列腺癌无效。

目前对于INF治疗肿瘤的发展趋势为INF联合化疗治疗，比如INF-a2b,900万IU,3次/周，联合5-FU750mg/m2,第一周连用5次后每周一次，获得比单用5-FU2倍的疗效。对于多发性骨髓瘤，INF-a2b联合CHOP方案，明显提高患者生存期。

另外，体外研究发现使用免疫增强方法能明显提高INF-a2b治疗效果，最常用和广泛研究的为卡介苗联合使用。体外实验表明加入重组卡介苗与可以增加外周血单核细胞INF分泌。同样与重组卡介苗、INF-a2b与NK细胞、CD8+T淋巴细胞共培养，较单独使用INF，细胞毒性增强2倍左右。

2.白介素-2（Interleukin-2, IL-2） 1975年，有研究者发现小鼠脾细胞培养液含有刺激胸腺细胞生长的物质，后来命名为IL-2。IL-2由4个15kD的a-螺旋蛋白组成，受体为IL-2Rα (CD25),IL-2Rβ (CD122), and γc (CD132)三个亚单位,主要是由Th1淋巴细胞分泌。功能包括以下几个方面：1.促进T淋巴细胞增殖及分化，体外IL-2维持T淋巴细胞存活，体内呈剂量依赖性诱导细胞毒性淋巴细胞（CTL）成熟。2.活化抗肿瘤细胞（LAK lymphokine-activated killer cell）3.增强NK细胞、单核细胞及B淋巴细胞活性及功

能。

体外实验及临床研究均发现IL-2对某些肿瘤有一定的治疗效果，国外研究表明，IL-2治疗肿瘤的合适剂量为静脉注射100-300x105 U（m2•d）,每3周连用5-7天以上方法治疗肾癌及黑色素瘤有效率为15-25%，但该药半衰期极短，α相仅为6.7min, β相为70分钟。

早期研究表明除肾癌与黑色瘤外，IL-2对其他肿瘤疗效欠佳。近年来，国内外均有报道通过介入将IL-2注射入肝癌瘤体，发现瘤体明显减小以及AFP下降。 将IL-2与INF或化疗药物联合使用可能明显提高肿瘤患者的治疗效果，但多数资料仍然局限在对肾癌或黑色素瘤的治疗，比如：有研究报道IL-2配合INF,联合DDP、VBI、DTIC治疗广泛转移的黑色素瘤患者，有效率为60%，其中CR患者约20%。除肾癌和黑色素瘤以外，使用IL-2治疗低度恶性的膀胱肿瘤也可能取得一定的治疗效果。

其他有可能用于肿瘤免疫治疗的细胞因子还包括TNF、IL-10拮抗剂以及IL-12等。TNF作用包括以下几个方面：1.直接溶解肿瘤细胞，2.抗血管内皮细胞增殖作用，3.促进IL-2分泌及γc受体表达。国外研究发现TNF400mg/kg有相当抗肿瘤作用，用药1小时后即可发现瘤体缩小。在临床研究中，人体最大耐受剂量为200mg/kg,2次/周，共用8周，临床有效率小于5%。IL-12的作用主要协同IL-2或刺激IL-分泌。小鼠实验也表明IL-12联合化疗效果明显优于单独化疗，但临床研究未发现有效报道。IL-10主要促进Th2细胞作用，肿瘤微环境中IL-10分泌过多被认为是肿瘤细胞免疫逃逸机制之一。IL-10基因敲除小鼠表现出对膀胱癌预防作用，同样IL-10中和性抗体也出现同样作用。最近研究发现联合使用卡介苗及IL-10R1抗体可以阻止MB49膀胱癌细胞种植鼠肿瘤转移，但目前无临床研究数据。

（二）肿瘤免疫细胞治疗

肿瘤细胞免疫治疗自从19世纪80年代开始发展，尤其近年取得了重要进展。 肿瘤细胞免疫治疗主要包括过继回输各种类型的淋巴细胞．有淋巴因子激活的杀伤细胞(1ymphokine activated killer，LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)等，还有自体抗原提呈细胞如树突状细胞(dendritic cell，DC)等。

1. DC细胞为基础的免疫治疗

目前DC细胞在肿瘤的生物治疗中的临床应用主要有以下几种形式：①DC疫苗：用相关肿瘤抗原致敏DC，然后回输体内，能激活体内针对相关肿瘤抗原的细胞毒作用，杀伤肿瘤细胞。②Dc-T细胞：通过体外相关肿瘤抗原致敏DC，激活细 胞毒性T细胞，通过回输效应性T细胞，达到杀伤体内肿瘤细胞的作用。

有实验表明，以小鼠肠癌细胞冻融物刺激DC，发现其可促进DC分泌IL-12及IFN ，增强DC的抗癌作用。在晚期肝癌的临床研究中，采用单剂量放疗联合瘤体内注射自体未成熟DC，结果显示该疗法安全且诱导了特异和非特异性抗肿瘤免疫效应。有学者对系统免疫治疗和局部免疫治疗的效果进行了分析，结果表明，在生存期、复发率和副反应上，局部免疫治疗均好于系统免疫治疗。对于原发性肝癌或转移性肝癌来讲，局部的免疫治疗可能是一个较为有效的手段。

有临床研究采用肿瘤特异性抗原负载患者外周血DC用于治疗滤泡型B细胞淋巴瘤，接受治疗的4例患者均产生明显的抗肿瘤免疫应答，其中1例患者肿瘤完全消退，1例部分消退。另外，采用患者白体免疫球蛋白独特型作为抗原负载DC进

行I、Ⅱ期临床试验治疗多发性骨髓瘤，结合皮下和静脉两种方式输注，经过治疗的15例患者中，7例病情稳定， 例有所缓解，7例病情恶化，其中有4例迟发型超敏反应。目前关于使用DC细胞治疗肿瘤报道最多的为黑色素瘤，其次为前列腺癌、肾癌、乳腺癌、白血病、结肠癌等一系列恶性肿瘤的临床治疗中取得了较好的疗效，目目前部分DC疫苗已进入I、Ⅱ期临床试验。

DC在体内的数量极微，难以满足研究和临床治疗的需要。2O世纪9O年代以来，体外诱导培养DC取得了巨大进步，使得DC疫苗在抗肿瘤治疗方面得以快速发展。目前用于免疫治疗的DC主要来源于骨髓或外周血CD34+造血祖细胞、外周血DC及单核细胞，其中以单核细胞来源的DC应用最为广泛。单核细胞在粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolony-stimulating factor，GM-CSF)和I 4共同作用下诱导分化为不成熟DC，并在某些外来因素刺激下进一步分化为成熟DC。亦可将来源于骨髓或外周血CD34+造血祖细胞在体外与GM-CSF和肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor a，TNF-a)共同培养，获得大量DC。除上述2种体外，DC还可直接从外周血中分离纯化而得。进一步研究发现，Flt3配体(fms-like tyrosine kinase 3 ligand，Flt3L)可动员DC进入外周血，显著增加外周血中DC的数量，有利于直接分离得到大量DC。

DC细胞成熟或激活一般使用肿瘤裂解物负载DC细胞，该法不仅不需要分离鉴定肿瘤抗原，还可提供多种抗原表位供DC识别，进而诱导广泛的T细胞应答。具体应用时可采用肿瘤细胞裂解物、凋亡的肿瘤细胞 或肿瘤的mRNA来负载DC，也可通过聚乙二醇或电融合技术将DC与肿瘤细胞融合。利用上述抗原负载方法亦各有其优缺点：(1)用肿瘤细胞裂解物作为抗原刺激DC，虽可产生明显的抗肿瘤效应，但需要较多肿瘤组织，且抗原成分复杂，可能含有机体的自身抗原，有诱发自身免疫性疾病的危险。以肿瘤的mRNA为抗原负载DC，或通过电穿孔技术将肿瘤mRNA导入DC，其优点在于能通过核酸扩增技术从有限的肿瘤组织中扩增得到足量的mRNA，同时也可避免由自身抗原诱发的自身免疫性疾病。将DC与肿瘤细胞融合，可借助DC表面高表达的MHC分子及共刺激分子，将肿瘤抗原有效地递呈给T淋巴细胞。但后两种方法操作较复杂，难以获得大量有效DC细胞。最近研究表明使用PTEN（phosphatase and tensin homologue）siRNA转染DC，GM-CSF基因修饰以及拮抗IL-10受体均不同程度增加成熟DC细胞诱导CTL作用。

DC疫苗作为肿瘤免疫治疗的一项重要手段已显示出巨大的临床应用价值，其主要通过启动患者自身特异性肿瘤免疫反应，增强机体抗肿瘤能力，在杀伤肿瘤细胞的同时又可减少对机体正常细胞的损害。然而DC疫苗在临床应用过程中仍 存在许多问题，如不同种类及不同成熟状态DC的选取，针对不同的肿瘤采用何种肿瘤抗原及DC负载方法，疫苗的使用剂量、接种途径及免疫频率，疫苗效果评价等均需进一步探讨。 2.CIK细胞免疫治疗

CIK细胞是上世纪80年代中期Schmidt．wolf从外周血单个核细胞中诱导产生，同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，兼具T淋巴细胞强大的杀瘤活性和NK细胞的非MHC性，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞。

CIK获取一般使用密度梯度离心方法常规分离健康成人外周血，制备单个核 细胞悬液，调整细胞浓度为1 x lO6个／ml进行培养，于培养过程中顺序加入干扰素γ、IL-2、IL-1等细胞因子至关重要。 CIK细胞杀伤肿瘤细胞机制目前包括：1.非MHC性细胞外毒性作用，通过FcR使LFA-1和ICAM-1的结合状态从低亲和力转为高亲力，同时向细胞间排出含有

a-氮、甲苯碳酰基左旋赖氨酸硫甲苯酯(BLT)的胞浆毒性颗粒。这些颗粒能够直接穿透封闭的靶细胞，从而导致肿瘤细胞的裂解，另外 CD3样受体介导，升高细胞浆内cAMP的浓度，同样可以释放BLT细胞毒性颗粒杀伤肿瘤细胞。2. 培养的CIK细胞分泌多种细胞因子，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，而且还可通过调节免疫系统间接杀伤瘤细胞。用CIK治疗慢性淋巴细胞自血病(CLL)的研究中发现CIK分泌的IFN-γ能促使CLL细胞上ICAM-1的表达，增加肿瘤细胞表面MHCI表达、可减缓肿瘤细胞增殖速度；此外 CIK细胞所分泌的TNF-a、IL-2，均具有活化增强巨噬细胞、NK(自然杀伤细胞)、CTL具有抗肿瘤作用。3. CIK细胞活化肿瘤细胞凋亡基因，使得FLIP、Bc1-2、Bcl-xL、DAD1和survivin基因表达上调。此外，C1K细胞表达的FasL可诱导肿瘤细胞凋亡。另外， CIK细胞高表达caspase8，但不表达或仅低表达FADD(具有死亡结构域的Fas相关蛋白)。而FADD的缺乏阻止了 介导的凋亡信号的产生。另外，CIK细胞表达C—cFLIP蛋白，cFLIP能阻止FADD/ caspase8的相互作用形成死亡诱导信号复合物，同样阻止凋亡信号的产生，故CIK能对肿瘤细胞发挥持久的溶瘤作用，作为输送体系将溶瘤病毒直达肿瘤病灶治疗肿瘤。在研究CIK细胞对MGC803胃癌细胞株诱导凋亡作用及机制中证明：随着CIK细胞与胃癌细胞效靶比增加及作用时间延长，抑制率明显增强。4.促进T细胞增殖活化CIK细胞体内抗瘤作用可能与促进宿主体内T细胞增殖活化有关，并推测 原始的CD3+ CD56+ T细胞随CIK输注体内后，通过TCR/CD3复合体的刺激导致增殖及细胞毒活性增加。

自从上世纪90年代CIK技术应用临床以来，CIK已经证明细胞免疫治疗肿瘤的有效方法之一，并且应用最为广泛。2000年，柳叶刀杂志报道了利用此方法进行的肝癌随机治疗试验。在此试验中，经过根治性肿瘤切除术的肝癌病人随机分为两组，一组进行CIK治疗，另一组不进行治疗。统计结果显示，经过CIK治疗的病人肝癌复发的危险降低了41％。国内报道治疗晚期肿瘤患者有效率为35-73%。我院通过CIK技术治疗肿瘤晚期达600多例，总体有效率达到63.4%，临床有效指标最明显的为患者自我感觉明显好转，包括疼痛、睡眠、精神、食欲及体重增加等，另外肿瘤相关并发症比如肿瘤转移性胸水、腹水可见明显消退。CIK细胞治疗恶性肿瘤虽然有广阔的前景，但目前仍有许多问题需要解决，比如：对CIK细胞的作用机制还未完全了解；对其毒副作用和治疗效果还缺乏大规模随访及对照研究；大容量制备CIK细胞回输技术不成熟和价格昂贵等，如何更好地将CIK治疗和其他治疗手段结合，均需要进一步研究。

3.LAK细胞治疗

同样在20世纪80年代，研究发现经IL-2体外刺激后，外周血单个核细胞中的部分细胞可被特异性活化、扩增，并具有杀伤肿瘤细胞的作用。这些细胞即淋巴因子活化的杀伤细胞(1ymphokine activated killer，LAK细胞)。LAK细胞的主要效应细胞为IL-2活化的NK细胞。最早的研究发现，这些 胞在体外具有杀伤白血病细胞的能力。由于LAK细胞属于非B非T细胞，因此，这种杀伤是非HLA 性的，代表了机体天然免疫系统对肿瘤细胞的监视和杀伤作用。通常情况下，NK细胞不经干扰素(IFN)、IL-2的活化，或去除抑制性单核细胞时，对自体的白血病细胞没有杀伤作用。经IL-2活化的T淋巴细胞和NK细胞可分泌 IFN-γ，导致白血病肿瘤细胞被NK细胞杀伤。除白血病外，一些体外试验表明，LAK细胞对动物和人的恶性黑色素瘤、肾癌、非何杰金淋巴瘤、肺癌及结直肠癌也有一定的效果。然而，受到体外可扩增效率的、化疗对淋巴细胞的影响，LAK细胞在体内的抗肿瘤效果不理想。因此，目前使用LAK方案治疗肿瘤应用较少。

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