国际检验医学杂志２０１０年３月第３ｌ卷第３期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｍａｒｃｈ ２０１０，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．３ ・ ２６７ ・ ・综述・ 肺炎支原体检测方法的临床应用 陈恩利 综述，孔路科。审校 （１．山西省晋城市第二人民医院儿科０４８０００；２．山西省晋城市人民医院检验科０４８０００） 【摘要】肺炎支原体是引起人类非典型肺炎主要的病原体之一，临床表现常无特异性，快速、准确的实验室诊断可以及时有 效地指导临床治疗。现对目前国内外采用的肺炎支原体诊断方法进行探讨比较，以期能为临床医师选用合适的检测方法 作出及 时准确的诊断提供参考。 【关键词】支原体，肺炎； 实验室技术和方法； 诊断 中图分类号：Ｒ３７５．２；Ｒ４４６．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１ ６７３—４１３０（２０１ｏ）０３—０２６７—０３ 肺炎支原体（ｍｙｅｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＭＰ）是人类原发性 因念珠菌的存在而引起的假阳性所造成的误诊误治。 非典型肺炎的病原体，主要由口、鼻分泌物经空气传播，可引起 散发或小流行的呼吸道感染，主要为咽炎和支气管炎，部分累 免疫学检测法 及肺而引起肺炎。肺炎支原体作为婴幼儿、青少年呼吸道感染 ＭＰ侵入机体后多克隆激活Ｂ淋巴细胞，产生非特异的与 的主要病原体之一，感染后临床表现常无特异性，易与其他病 支原体无直接关联的抗原的抗体，如针对红细胞膜Ｉ抗原的冷 毒、细菌所致的呼吸道感染相 昆淆，近年来ＭＰ感染的发病年 凝集素 ｊ。此外肺炎支原体感染后可产生针对ＭＰ的特异性 龄有提前的趋势，且年龄越小临床表现越不典型。能够在早期 ＩｇＭ、ＩｇＧ及ＩｇＡ抗体及分泌型ＩｇＡ抗体。其中抗ＭＰ—ＩｇＭ是 快速地对感染ＭＰ的患者进行确诊，可以避免抗生素的滥用， 机体受ＭＰ感染时最早出现的特异性抗体，该抗体于发病后 能给患者提供及时有效的治疔，减轻患者的经济负担。 １～２天即可检出，１个月左右达到高峰，检测抗ＭＰ—ＩｇＭ抗体 目前针对ＭＰ的实验室诊断技术主要有培养法、免疫学检 可以早期诊断ＭＰ感染。 测法、ＤＮＡ检测法，各种方法均有其优缺点，结合患者的临床 目前常用的血清学检测方法主要有冷凝集实验、明胶颗粒 表现，可选用一种或多种方法进行检测。 凝集法和酶联免疫吸附法。冷凝集试验因其方法简单、易行， 培养法 长期以来成为诊断肺炎支原体的传统方法，但敏感性和特异性 均较差了它的应用，当前实验室中主要是应用明胶颗粒凝 培养法是鉴定ＭＰ感染的金标准。支原体对培养基的营 集法和酶联免疫吸附法来测定血清中ＭＰ的特异性抗体，它们 养要求非常高，最适ｐＨ为７．６～８．６，以二方式繁殖，速度 之间检测的阳性率高低各家报道不尽相同，但整体而言，要比 较细菌慢，在固体培养基上有埋人培养基中生长的趋势，可形 冷凝集法要高，成为血清法检测肺炎支原体的主要技术。 成“荷包蛋”状细小菌落，即部分不透明并生长到培养基 明胶颗粒凝集法是将ＭＰ细胞膜成分致敏人工明胶颗粒， 内，其四周为半透明的扁平区，在实验室培养中出现即可确诊 致敏粒子再与人血清中存在的ＭＰ抗体发生凝集反应，操作简 为支原体Ⅲ。 单、迅速，并尽可能消除红细胞载体引起的非特异性凝集，凝集 通常使用的固体培养基有培养时间长、操作复杂、阳性率 图像清晰，过夜后再判读不发生显著变化，灵敏度为１：３２０左 低等缺点，不利于临床的快速诊断，导致患者得不到及时有效 右，特异性强，未出现假阳性结果，重复性好，适于早期诊断 ｊ。 的治疗。目前实验室中应用的快速液体培养法，是利用ＭＰ生 酶联免疫吸附法（Ｅｌ ＩｓＡ）间接法检测血清中ＭＰ抗体，其 长代谢产物使培养基液体中指示剂颜色发生改变来判断ＭＰ 敏感度和特异性都较好，操作较简便、快速，实验过程仅需ｌｈ 的生长，标本中其他支原体和细菌则因培养基中加人了青霉 左右。吴跃平和赵瑞珍［６ 通过对临床诊断为ＭＰ的２４７例患 素、醋酸陀和生物抑菌剂而被抑制 ］。咽部分泌物、痰液、支气 儿和非ＭＰ感染７７６例进行ＩｇＭ的ＥＩ ＩＳＡ检测，结果ＭＰ感 管分泌物等均可作为标本进行ＭＰ的培养，边兴艳等通过对拟 染组ＩｇＭ阳性率为８５．ｏ２ ，而非ＭＰ感染组ＩｇＭ阳性率仅 诊为呼吸道感染的３８０例患儿的咽拭子进行培养，其中１５３例 为６．３１ ，两组别间差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．００１），表明肺 为ＭＰ阳性，阳性率达到４０．２ ，并得到将咽拭子直接接种到 炎支原体ＩｇＭ的ＥＬＩＳＡ检测结果与临床有较高的符合率和 培养基中可缩短报告的时间，４８内可得到阳性结果，且操作简 特异性。 便，实验室条件要求不高，易被临床接受，可明显缩短ＭＰ培养 以上各种检测被检者血清中ＭＰ抗体水平的方法，可间接 法的检测时问。 提示ＭＰ感染的存在，但ＭＰ上的Ｐ１蛋白与生殖支原体（ｍｙ— 在ＭＰ培养法的阳性高检出率背后潜藏着一定的假阳性。 ｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌ，Ｍｇ）的ＭｇＰａ蛋白是同源蛋白，在基因水平 李丽霞 通过对９Ｏ例ＭＰ阳性标本进行念珠菌培养，结果念 上有４８ 的同源序列，拥有部分共同抗原决定簇，故存在交叉 珠菌阳性３Ｏ例，阴性６Ｏ例，认为在念珠菌培养阳性时，ＭＰ培 反应，有出现假阳性结果的可能。采用多克隆抗体来检测ＭＰ 养阳性率也大幅提高，二者存在一定的相关性，且不同年龄段 抗原，由于多克隆抗体的特异性不高，交叉反应严重，应用较 增高幅度不同，建议在行ＭＰ培养时，同时行念珠菌培养，避免 少，目前主要使用单抗来检测ＭＰ抗原，敏感性强，特异性高。 通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｃｅｌｌ９６０６１＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ。 ＤＯＩ：１０．３７６０／ｅｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１０．０３．０２６ ・ ２６８ ・ 国际检验医学杂志２０１０年３月第３１卷第３期Ｉｎｔ Ｊ Ｉ ｂ Ｍｅｄ，Ｍａｒｃｈ ２０１０，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．３ 涂少华等啪通过采用不同株的ＭＰ单抗，建立双抗体夹心 ＥｕＳＡ法检测ＭＰ抗原，灵敏度高，特异性强，与种属相近的 支原体没有交叉反应，对１４７份临床标本进行了ＭＰ抗原的检 测，同时用ＰＣＲ方法作平行测定，结果两种方法的检测结果无 显著性差异。 基因检测法 异有显著性 。姜怡等１ 还介绍了荧光偏振和多重聚合酶 ］链技术对肺炎支原体的检测，将荧光偏振检测技术与模板指导 的ＤＮＡ末端延伸反应（ＴＤＩ—ＦＰ）结合，通过检测偏振光强度来 达到检测ＭＰ的目的，相比普通ＰＣＲ采用琼脂糖凝胶电泳等 手段对检测结果观察分析，人为误差大，假阳性、假阴性率高， 实时荧光ＰＣＲ需特异标记的探针，实验成本高而言，荧光偏振 技术灵敏度高，快速、简单、准确，可成为一种临床实验室基因 诊断的新方法。 肺炎支原体基因组ＤＮＡ全序列长８１６ ３９４ ｂｐ，相对分子 质量５．１×１０ ，为大肠杆菌基因组的１／５，其蛋白产物有相对 分子质量为１６８×１０。，１７０×１０。，１３０×１０。，９０×１０。，４５×１０。， 综上所述，培养法仍是检测ＭＰ的金标准，快速培养法在 保持高阳性检出率的同时，明显缩短了检测时间，但在临床中 ３５×１０。的多种蛋白，有些菌株还有１１０×１０。大小的蛋白产 患者检测前已经使用的ＭＰ敏感药物会导致检出率下降，所以 物。其中相对分子质量为１７０×１０。的蛋白研究最为透彻，是 提示病程较短的患者选择此方法阳性检出率较高，同时还要注 位于突起部的Ｐ１黏附蛋白，在介导ＭＰ对人类呼吸道上皮细 意念珠菌导致的假阳性出现。检测患者血清中ＭＰ抗体的方 胞的黏附过程中起到了关键作用，其基因序列已全部阐明［８］。 法由于操作简便、所需时间短等优点在临床检测中应用最为广 肺炎支原体核糖体的大小约为７０Ｓ，内含５Ｓ、１６Ｓ及２３Ｓ ３种 泛，但因其不是直接检测ＭＰ本身，故阳性结果并不能确诊就 ｒＲＮＡ，并有５Ｏ种左右的蛋白质，其中１６Ｓ ｒＲＮＡ有较保守的 是ＭＰ感染，另有一些ＭＰ感染的患者不产生抗体或只产生少 重复序列，且有种属特异性。 量的抗体，而高抗体滴度的样品则会出现前带现象，这些都可 １９８９年Ｂｅｒｎｅｔ等首先将ＭＰ的一段特异的染色体ＤＮＡ 能对检测结果造成不良影响，故此方法针对发病时间较长或经 片段克隆出来，并进行测序，设计出目的片段为１４４ ｂｐ的引物 过多种药物治疗过的患者有较高的阳性率。基因检测法的高 Ｍｐ５—１：５＇－ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＧＧＴ ＴＧＧ一３ 和Ｍｐ５— 敏感性、高特异性在能够对微量样本和早期感染样本进行检测 ２：５ ｒ＿ＡＴＴ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧＧ－３ ，可直接用于临 的同时，也容易因为操作不当或环境因素而受到污染导致结果 床标本的检测。Ｊｅｎｓｅｎ等根据ＭＰ的１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的可变 的不可靠，另外该法要求特殊的仪器、较高的人员素质也是限 区和Ｐ１蛋白的基因序列，设计出目的片段分别为５８３ ｂｐ和 制其使用的因素。 １５３ ｂｐ的２对引物。詹群珊等 采用上述的３对引物分别对 在临床实际工作中，应该针对患者就医时的症状及用药情 肺炎支原体培养物进行扩增，在特异性和敏感性方面作了对 况选择合适的方法进行检测以提高ＭＰ的阳性检出率及诊断 比，选出了在特异性和敏感性均较好的一对引物，为临床实验 的准确率。 引物的选取提供了参考。 随着对肺炎支原体基因组和蛋白组学的进一步深入研究， 目前针对ＭＰ的基因检测法主要有普通ＰＣＲ、实时荧光 对ＭＰ感染发病机理的更深认识，以及检测技术不断更新，针 ＰＣＲ、套式ＰＣＲ、反向斑点杂交法。Ｐ１黏附蛋白、１６Ｓ ｒＲＮＡ和 对肺炎支原体的检测方法会更快速、更特异、更高效。 １６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ之间的内转录间隔区序列（ＩＴＳ）常作为ＰＣＲ检 测ＭＰ的靶序列用来设计引物，在实际应用中显示了较好的特 参考文献 异性和敏感性＿１ 。Ｔａｋａｈａｓｈｉ等根据肺炎支原体ＩＴＳ序列设 ［１］袁育康．医学免疫学与病原生物学［Ｍ］．北京：北京医科 计引物，其检测灵敏度达１０ ｐｇ／５ Ｌ，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交可提 大学出版社，２０００：８． 高到１００ ｆｇ／５Ⅱ “］。谷祯梅等ｌ１ 针对肺炎支原体１６Ｓ ｒＲＮＡ ［２］蒋玉莲，黄彩芝，赖源，等．儿童三种肺炎支原体检测法的 的高度保守区域设计引物和探针，建立实时荧光ＰＣＲ对呼吸 临床应用分析［Ｊ］．中华现代临床医学杂志，２００７，５（１）： 道感染者的咽拭子样品进行检测，能够检出病毒载量约为 ５６—５７． １０。／ｍＬ的样本，同时用同种方法对其他常见的呼吸道病原体 ［３］李丽霞．肺炎支原体培养阳性与念珠菌的相关性［Ｊ］．现 的也进行了扩增，发现与这些病原体无交叉反应，说明实时荧 代检验医学杂志，２００３，１８（６）：３． 光ＰＣＲ具有较好的特异性和敏感性，且可以明显缩短肺炎支 ［４］马红秋，辛德莉．肺炎支原体的致病机制ＥＪ］．临床和实验 原体确诊的时间，有利于临床的早期快速诊断。套式ＰＣＲ通 医学杂志，２００６，５（５）：６２２ ６２３． 过外套引物的扩增能够增加起始模板量，而内套引物则可将目 ［５］谢国艳，高志生，郁淼，等．肺炎支原体检测方法的评价 的基因进一步倍增至可观察的量，可提高ＰＣＲ检测的灵敏度， ＥＪ］．世界感染杂志，２ｌ（）（）５，５（５）：４４４． 保证产物的特异性，使灵敏度和特异性在理论上高于传统的 ［６］吴跃平，赵瑞珍．小儿肺炎支原体感染ＩｇＭ抗体检测分析 ＰＣＲ技术¨】 。Ｓｃｈｏｅｂ等建立的套式ＰＣＲ方法，检测３５９例大 ［Ｊ］．国际检验医学杂志，２００６，２７（７）：６５６—６５７． 鼠气管冲洗液标本中的肺炎支原体，阳性率为７．０ （２５／ ［７］涂少华，叶元康，沈昭在，等．双抗体夹心ＥＩ ＩＳＡ检测肺 ３５９），而普通ＰＣＲ阳性率为０．３ （１／３５９），且在普通ＰＣＲ中， 炎支原体抗原方法的建立及临床应用［Ｊ］．现代医学， 扩增抑制物造成的假阴性占９．８ （３５／３５９），而套式ＰＣＲ则减 ２００４，３２（６）：３９０—３９２。． 少到４．２％（１５／３５９）。 ［８］叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程［Ｍ］．３ 樊慧珍等根据肺炎支原体特异的Ｐ１基因设计引物，通过 版．南京：东南大学出版社，２００６：１１． 聚合酶链反应合成一段特异的１６２ ｂｐ长链ＤＮＡ探针，采用反 ［９］詹群珊，吴旗，曾真，等．不同引物检测肺炎支原体的研究 向斑点杂交法来检测生物素标记的肺炎支原体ＤＮＡ，并和其 ［Ｊ］．河北医学，２００２，８（８）：６７３—６７５． 他病原体无交叉反应，故具有高度的特异性，与培养法相比差 ［１Ｏ］李玉华，李红．肺支原体研究进展［Ｊ］．（下转第２７０页） ・ ２７Ｏ ・ 国际检验医学杂志２０１０年３月第３１卷第３期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｍａｒｃｈ ２０１０，ｖ０Ｉ．３１，Ｎｏ．３ 析。其优点是有效避免了普通ＰＣＲ操作中的污染问题；操作 简便、快捷，结果准确，克服了传统ＰＣＲ技术不能定量分析的 缺点；扩增后不需电泳或放射自显影；对每一批扩增样本都可 进行扩增效率的分析，但ＦＱＰＣＲ法技术要求高，需要专门的 仪器设备和技术人员操作，价格昂贵，不易在临床普及。 ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ或ＦＱ－ＰＣＲ等方法，可提高ＭＰ的检测阳性率。 参考文献 Ｅｌｉ Ｗａｉｔｅｓ ＫＢ，Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎ ＤＦ．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ａｓ ａ ｈｕｍａｎ ｐａｔｈｏｇｅｎ［Ｊ￣．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，１７ （４）：６９７ ７２８． ３．ＭＰ培养 １）传统的ＭＰ分离培养与鉴定：患者的痰 或咽拭子标本，接种于含血清或酵母浸膏的琼脂培养基中，５～ １０ ｄ后观察直径为３Ｏ～１００ ｐｔｍ的圆形房顶样或“荷包蛋”样 ［２］吴跃平，赵瑞珍．小儿肺炎支原体感染ＩｇＭ抗体检测分析 ＥＪ］．国际检验医学杂志，２００６，２７（７）：６５６—６５７． ［３］杨家树，刘朝东．小儿肺炎支原体感染率调查［Ｊ］．实用医 技杂志，２００８，１５（３）：７８—７９． 菌落的形成。ＭＰ可发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸与尿 素，可通过生长抑制实验（ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｅｘｔ，ＧＩＴ）和纸片 法代谢抑制实验（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ＭＩＴ）来鉴定Ｉ５］。传 ［４］赵顺英．肺炎支原体感染的临床表现和肺外并发症［Ｊ］． 实用儿科临床杂志，２００７，２２（４）：２４９． 统的ＭＰ分离培养需３周甚至更长时间，且阳性率不高，培养 要求苛刻，临床快速诊断ＭＰ感染意义不大。２）快速ＭＰ培 养：ＭＰ快速培养法是利用ＭＰ在选择性液体培养基中生长， 其代谢产物可使培养基颜色发生改变的特点来判断ＭＰ是否 生长的方法。ＭＰ快速培养基主要由牛心浸出液、胎牛血清、 酵母提取液、快速组合生长因子、抑菌剂、抗生素、酚红指示剂 等组成，培养基中的抑菌剂可抑制标本中其他支原体和细菌生 长。将患者咽拭子浸入培养液，于３５℃～３７。Ｃ孵育２４ ｈ后观 察结果，培养基由红色变为黄色１ ，］且仍保持澄清，说明有ＭＰ 生长，为阳性。 ［５］张卓然，倪语星．１临床微生物学和微生物检验［Ｊ］．北京： 人民卫生出版社，２００１：２９１—２９２． ［６］朱宏，计雪强．肺炎支原体抗体的定量检测及临床意义 ｌ＿Ｊ］．国际检验医学杂志，２００７，２８（９）：７８８—７９２． ［７］赵茹，黄莉．双份血清ＭＰ抗体及痰ＭＰ—ＰＣＲ检测在儿童 肺炎支原体感染诊断中的价值ＥＪ］．江苏医药，２００８，３４ （１２）：１２８２—１２８３． ［８］张云娇．小儿呼吸系统感染后肺炎支原体抗体检测的作 用ＥＪ］．国际检验医学志，２００８，２９（１０）：９２３． ［９］叶明新．儿童肺炎支原体培养与肺炎支原体抗体检测的 比较［Ｊ］．实用临床医学，２００８，９：８２—８３． ［１Ｏ］蒋玉莲，黄彩芝，赖源．儿童三种肺炎支原体检测法的临 ＭＰ快速鉴定培养显著缩短了ＭＰ的培养时间，较好地满 足了临床快速检测的需要；且免除了儿童抽血化验的痛苦，不 需要特殊设备，一般实验室均可开展应用，临床符合率达９５ 以上，适合临床呼吸道患者早期ＭＰ感染的筛查。但与传统 ＭＰ培养一样，临床用药对结果的影响较大，结果判读时尤需 注意假阴性ｌ 。】 结 语 床应用分析［Ｊ］．中华现代临床医学杂志，２００７，５（１）：５６— ５７． ［１１］傅桂莲，樊绮诗．分子生物学检验技术［Ｍ］．北京：人民卫 生出版社，２０００：１２５． ［１２］毛红菊，林东舫，徐晓刚，等．利用基因芯片快速检测多种 临床常见致病菌及耐药基因［Ｊ］．中华传染病杂志，２００６， ２４（６）：３７２—３７７． 综上所述，早期快速地检测ＭＰ对于临床早期明确诊断、 指导合理用药具有重要意义。目前用于检测ＭＰ感染的实验 室检测方法中，传统的分离培养要求高，耗时长；免疫学方法主 ［１３］钱新宏，张国成，许东亮．肺炎支原体快速鉴定培养基在 要检测血清中的ＭＰ特异性抗体，阳性结果并不能确诊是否有 ＭＰ感染；ＰＣＲ法快速、敏感、特异，但易受污染出现假阳性结 果；ＭＰ快速培养法以其方便快捷、特异性高，值得在临床推 广。选择合适的ＭＰ检测方法应依据患者的年龄、病程及用药 情况等，门诊疑似患者可采用免疫金标斑点法进行筛查，初发 患儿宜及早进行ＭＰ的快速鉴定培养，用药后患者采用 儿童支原体感染快速诊断中的应用［Ｊ］．现代检验医学杂 志，２００６，２１（５）：７１－７２． ［１４］周金风，黄秀琼．１ ３６２例呼吸道感染患者痰、咽拭子肺炎 支原体培养结果分析［Ｊ］．现代医院，２００６，６（６）：８６—８７． （本文编辑：杨庆华收稿日期：２００９—０６—２１） （Ｉ－接第２６８页） 中国比较医学杂志，２００７，１７（７）：４１３—４１６． ［１１］Ｔａｋａｈａｓｈｉ—Ｏｍｏｅ Ｈ，Ｏｍｏｅ Ｋ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａｓ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｌｙ— ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ｉｎ ｔｈｅ １ ６Ｓ ［１３］李彦明，张映．套式ＰＣＲ在支原体检测中的应用［Ｊ］．中 国预防兽医学报，２００５，２７（３）：２３７—２４０． ［１４］樊慧珍，于化鹏，黄文杰，等．反向斑点杂交法快速检测肺 炎支原体＿Ｊ］．实用医学杂志，２００５，２１（２１）：２３４９ ２３５１． ［１５］姜怡，王玲，伍雪艳，等．荧光偏振和多重聚合酶链技术在 ２３ＳｒＲＮＡ ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｕｌ ｍｏｎｉｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎ ｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００４，２７（２）：１１７—１２８． 肺炎支原体、肺炎衣原体检测中的应用［Ｊ］．第四军医大 学学报，２００７，２８（１５）：１３８６—１３８８． （本文编辑：杨庆华收稿日期：２００９—１０—０８） ［１２］谷祯梅，向春艳，袁忠，等．检测肺炎支原体的实时荧光 ＰＣＲ方法的建立［Ｊ］．热带医学杂志，２００８，８（７）：６５２— ６５４．
