流式细胞仪简介
▲流式细胞仪主要由五部分组成
1.流动室和液流系统； 2.激光源和光学系统； 3.光电管和检测系统； 4.计算机和分析系统； 5.细胞分选系统
1.流动室的基本结构
流动室是仪器的核心部件，被测样品在此与激 光相交，得到准确的细胞荧光信息。
2.激光源和光学系统
通常以激光作为发光源（氩离子气体激光器和 小功率半导体激光器）。被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
3.光电管和检测系统： 通过光电转换器转变成电信号而进行测量。 ▲二种探测器和二类放大器
▲二种探测器:光电二极管和光电倍增管。
光电二极管对光的敏感度低于光电倍增管,用于探测FSC, 因FSC是强信号。 光电倍增管（PMTs）用于探测SSC,FL1,FL2,FL3,因为它 们是弱信号。 两类放大器:
线性放大器：输出信号辐度与输入信号成线 性关系。 对数放大器：输出信号和输入信号之间成常 用对数关系。 放大器的作用:可对信号进行微调。对 FSC,SSC,FL1,FL2,FL3可设置放大模式和放大增益。
4.计算机和分析系统
经放大后的电信号被送往计算机分析器。
荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物 质的浓度，经光电倍增管接收后转换为电信号，再通过模／数 转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
▲流式细胞仪系统流程：
标本→激光系统→流动系统→信号处理系统→放大系统 →计算机系统→结果打印
▲流式细胞仪有关的测量参数及数据处理
▲测量参数：
检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式 可供选择。 第一激光（488nm）激发出的 FL1,FL2,FL3, 第二激光（635nm）激发出的FL4。
▲数据处理：
主要包括数据的显示和分析。流式数据一般用 一维直方图、二维散点图来表示。
▲激发光光源波长488nm的示意图
▲测量参数：
1.散射光信号：前向角散射和侧向角散射（细胞的物理 [固有]参数）
(1)前向角散射，即FSC与细胞的大小（直径的平方）相 关，我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除样品 中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的 干扰。（一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～0.5μm）。
(2)侧向角散射，SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可以提供有关细胞内精细结构及颗粒性质的信 息
利用这两个参数可以对细胞进行分群，通过设门就可以 将具有一定SSC和FSC的细胞群从大量细胞中区分出来。
细胞的光散射特性
根据FSC/SSC，可区解红细胞处理后外周血 白细胞中的淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞 三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的 全血样本中找出血小板和红细胞等细胞群体。
2.荧光信号：
有两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发 出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是 经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的特 异荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分 析就能了解所研究细胞参数的存在与定量。
测量荧光信号的主要参数：
（1）荧光信号的线性测量和对数测量模式
（2 ）细胞高度、面积和宽度的荧光信号测量
（3）光谱重叠的校正(调节荧光补偿电压)，因 FL1、FL2、FL3是来自于同一点光源，它们之间 的补偿是不可避免的。
▲荧光信号线性测量和对数测量模式
线性测量：适用于在较小范围内变化的信号以 及代表生物学线性过程的信号，例DNA、RNA、 总蛋白含量的测量。
对数测量：在免疫学测量中常使用对数测量。
细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍甚至 几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上 清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。 （2 ）荧光信号的高度、面积和宽度
荧光信号的高度
荧光信号的高度（如FL2-H ）是对细胞高 度的荧光信号的测量。一般细胞表达采用 H检测，因为细胞高度的荧光信号虽有差 异，但不影响阴性群和阳性群细胞在各区 域的分布，从而通过统计学（正态分布）得到它们各自分布在不同区域的百分含量。
荧光信号的面积
一般对DNA倍体测量时采用面积（如FL2-A）， 这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更 能准确反应DNA的含量，当形状差异较大，而DNA含量相等的二个细胞，得到的荧光脉冲高 度是不等的，而经过对荧光信号面积积分后， 所得到的信号值就相等。 荧光信号的宽度
宽度（如FL2-W ）常用来区分双联体细胞，由于 DNA样本极容易聚集，当两个G1期细胞粘连在一起 时，其测量到的DNA荧光信号（FL2-A）与G2期细 胞相等，这样得到的测量数据G2期细胞比例会增高， 影响测量准确性。
通过设“门”排除双联体细胞，其原理是双联体细 胞所得到的荧光信号（FL2-W ）比单个G2期细胞大， 设“门”后得到真正的DNA含量分布曲线和细胞周 期。 （3）光谱重叠的校正
FITC探测器会探测到少量的PE光谱，而PE探测 器则探测到较多的FITC光谱。
▲数据处理： 直方图：显示一个参数与细胞之间的关系。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的 值，其单位是道数，可以是线性（line）或者对 数（log）。纵坐标是细胞数。
散点图： 散点图常被用来分析多参数数据，如CD4、 CD8、CD34、CD45等分子的表达，以及凋亡 周期特异性，早期凋亡的检测等
一般要了解的参数：
▲分析速度：分析速度为10000/s。
▲样品浓度：在105 ～10 7细胞/ml的数量级。
▲分析测量参数: FSC,SSC,FL1,FL2,FL3,FL4、 FL2- A, FL2- W及线性和对数测量模式。
▲常用流式软件
1.cellquest
cellquest是BD公司推出的针对流式的试验数据获取和分析 软件。界面友好，操作简单，是目前流式相关软件中应用 最多的软件之一。
获取：建立检测模板（选测样通道、设“门”、作象限图、 直方图），调节探测器和确定放大器测量模式可使所需信 号出现在二维点图的适当位置。
分析：建立分析模板（设“门”、作象限图、直方图）， 经数学统计后得到分析结果。 ▲设门的概念
所说的设门，是指在进行检测时，所设的选择区域，可以用“门”选择 感兴趣的细胞群。（设门技术比较复杂，染色和上机都需要操作人员有 一定的经验）。
Cellquest的仪器控制：
▲有二种探测器：光电二极管和光电倍增管(PMTs) 光电二极管用于探测FSC ，因为FSC是 强信号。可通过调电压选择对FSC信号 的不同放大。
光电倍增管(PMTs)用于探测SSC、FL1、FL2、FL3 、FL4，因为它们是弱信号。PMTs的电压调节从150-999。当电压上 升时，信号增加，数据出现在道值较高 处。
放大器：可对信号进行微调。对FSC、 SSC、FL1、FL2、FL3可设置放大模式 和放大增益。放大模式选择Lin（线 性），放大器的增益在1-9.99之间调节。 放大模式选择Log（对数），放大器的 增益不可调节。对数常用于分开阴性信号和弱阳性信号。
阈值：可用来设置低于该道值的数据信号不被处理，只有高于或 等于阈值道数的信号才传送到计算机进行处理。在免疫表型中， 在FSC上设阈值。在DNA分析中，在FL2上设阈值。
补偿：当样本用2色或3色荧光染色时需调节补偿以消除光谱重叠。 补偿调节量依赖于探测器的电压。当补偿过后的群体与阴性群体 一致时，补偿调节正确。
