87例骨髓增生异常综合征多参数流式细胞术免疫表型分析

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87例骨髓增生异常综合征多参数流式细胞术免疫表型分析

首都医科大学宣武医院󰀁郭轶先󰀁孙雪静󰀁路继莲󰀁刘聪燕󰀁赵弘󰀁万岁桂󰀁徐娟*,北京󰀁100053

󰀁󰀁摘要󰀁目的:了解骨髓增生异常综合征(MDS)的免疫表型特征。方法:利用CD45/SSC参数散点图设门方法,对87例MDS患者的骨髓幼稚细胞群、成熟粒细胞群和成熟单核细胞群细胞表面分化抗原进行分析。结果:MDS的异常免疫表型可以分为抗原跨系列表达、抗原跨阶段表达、成熟粒细胞抗原分化异常、抗原表达缺失或表达增强、成熟粒细胞或幼稚细胞群CD45/SSC表达异常。78例(90.0%)MDS患者可以检测到明确的异常抗原表达,74例(85.1%)存在󰀂2个免疫表型异常,异常免疫表型不仅存在于幼稚细胞群(70.0%),也存在于成熟粒细胞群(81.6%)和单核细胞群(39.1%),常见的异常免疫表型包括:成熟粒细胞群CD13/CD16分化异常(41.3%);幼稚细胞群CD45表达异常(34.5%);成熟粒细胞群跨系列表达CD38(29.9%);幼稚细胞群CD34+CD11b+跨阶段表达异常(24.1%);成熟粒细胞群SSC减低(11.5%);成熟粒细胞群跨系列表达CD56(8%);单核细胞群跨系列表达CD56(8%)。随着患者骨髓幼稚细胞比例增高,异常免疫表型数量也逐渐增多。结论:在大多数MDS患者骨髓细胞中可以检测到明确的异常免疫表型,在此基础上应用多参数流式细胞仪可以有助于MDS的诊断和预后判断。

关键词󰀁骨髓增生异常综合征󰀁免疫表型󰀁多参数流式细胞术中图分类号󰀁R551.3󰀁R392.11󰀁󰀁󰀁文献标识码󰀁A

AnalysisofImmunophenotypebyMulti󰀁colorFlowCytometryin87CasesWithMyelodysplasticSyndrome󰀁GUOYix󰀁ian,SUNXuejing,LUJilian,etal.XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China

Abstract󰀁Objective:Tounderstandthecharacteristicsofimmunophenotypebymulti󰀁colorcytometryinpa󰀁tientswithmyelodysplasticsyndrome(MDS).Methods:FCMwithfourcolorandCD45/SSCgatingwereusedtodetecttheantigenexpressionofmyeloblast,granulocytesandmonocytesinsamplesofbonemarrowfrom87patientswithMDS.Results:TheabnormalphenotypesofMDScouldbedividedintofivegroupsasasynchronousantigenexpression,cross󰀁lineageantigenexpression,antigenoverexpressionorantigenlackexpression,abnormalpatternofantigenongranulocytes,andabnormalCD45/SSCexpressionongranulocytesormyeloblasts.Theresultsshowedthat78patients(90.0%)hadabnormalphenotypes,74patients(85.1%)had󰀂2abnormalphenotypes,abnormalimmunophenotypenotonlyexistinblasts(70.0%),butalsoingranulocytes(81.6%)andmonocytes(39.1%).TheabnormalimmunophenotypesincludedabnormalpatternCD13/CD16(41.3%),abnormalexpressionofCD45onblasts(34.5%),abnormalexpressionofCD38ongranulocytes(29.9%),abnormalexpressionofCD11bonblasts(24.1%),abnormalexpressionofCD56ongranulocytesandmonocytes(8%and8%).Thenumberofabnor󰀁malphenotypesweremoreinHIGHRISKMDSthanthoseinLOWRISKMDS.Conclusions:Theabnormalimmu󰀁nophenotypescanbedetectedinthemajorityofpatientswithMDSandFCMmayhelpidentifyMDS.

Keywords󰀁Myelodysplasticsyndrome󰀁Immunophenotype󰀁Multiparameterflowcytometry

󰀁󰀁骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyn󰀁drome,MDS)是一组异质性克隆性造血干细胞疾病,其生物学特征为骨髓粒系、红系、巨核系一系或多系发育异常(或称病态造血,disorderedmatura󰀁tionormyelodysplasia)和无效造血,可以伴原始细胞增多[1]。其抗原表达不完全同于正常血细胞,可出现某些抗原缺乏、跨系列表达或跨阶段表达等异

[2~8]

常,综合文献报道和本实验室FCM免疫分型检

测的经验总结,可将MDS的异常抗原表达归纳为以下5类:抗原跨系列表达异常;抗原跨阶段表达异常;抗原表达缺失;成熟粒细胞抗原分化异常;幼稚细胞群和成熟粒细胞群CD45/SSC异常。资料与方法

一般资料󰀁选择我院血液科2001年1月~2009年2月收治MDS患者87例(男51,女36),平均年龄60岁。所有患者都经临床观察、重复细胞形态学检查、染色体核型分析及除外营养性贫血、免疫*

通讯作者:徐娟,E󰀁mail:bjxwgyx@yahoo.com.cn

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内科急危重症杂志󰀁2009年󰀁第15卷󰀁第5期

性血细胞减少、慢性病贫血、PNH等其他疾病最终考虑诊断为MDS。FCM中髓系、淋系列抗原确定标准参照EGL评分[9],形态学诊断及分型表征参见 血液病诊断及治疗标准![10]。WHO标准分类结果:RA/RAS4例、RCMD/RCMDRS40例、RAEB∀/#35例、5q󰀁2例、MDS󰀁U6例。87例MDS患者中骨髓原始细胞󰀂5%高危MDS(RAEB∀/#)有35例,原始细胞<5%的低危MDS(主要为RCMD/RCMDRS)有52例。

实验材料及仪器󰀁所有标准单克隆抗体包括藻红蛋白(PE)、草履虫叶绿素蛋白(Per󰀁CP)、别藻蓝蛋白(APC)或异巯氰酸荧光素(FITC)标记的CD45、CD7、CD5、CD10、CD19、CD13、CD33、CD15、CD14、CD16、CD、CD34、CD11b、HLA󰀁DR、CD56、CD38、CD117及同型对照等均购自美国BectonDickinson公司。FACSCalibur流式细胞仪购自美国BectonDickinson公司。功率为15MW,激光光源采用氩离子气体激光器,波长为488mm,进行PE、FITC、Per󰀁CP等荧光素的检测,另配有小功率半导体激光器,波长为635nm,进行APC的检测。结合两个物理参数,前向散射光(for󰀁wardscatter,FSC)及侧向散射光(sidescatter,SSC),可进行4色6参数的综合分析。

标本处理、单克隆抗体标记󰀁骨髓液直接免疫荧光标记法。取患者骨髓液约3~5ml,肝素抗凝,磷酸盐缓冲液(PBS,pH值7.2~7.4)稀释后调节细胞浓度至(2~5)∃10个/ml,室温下进行单克隆抗体标记。各试管内先加入适量不同荧光素标记的单克隆抗体组合,再加入100󰀁l调整浓度后的单细胞悬液,充分混匀,室温下避光放置20min,然后加入2ml红细胞裂解液(FACSLyingsolution,BD),室温避光10min,离心(1500r/min)5min,去上清,PBS洗涤1次,将标记好的细胞溶于500󰀁l1%多聚甲醛溶液,PBS固定液4%保存,24h内上机检测。每次检测各种荧光素均设定相应抗体的同型阴性对照。

上机检测󰀁每次细胞获取前先用FACScomp自动软件分析标准荧光微球(CalibrationBeads,BD)以校准仪器。样本收集及结果分析均采用CellQuest(version3.2)软件进行。每管收集10000个细胞。采用CD45/SSC双参数散点图设门识别幼稚细胞群、成熟粒细胞群和成熟单核细胞群,分析计算门内细胞群中相关抗原的阳性率。设门内细胞大于相应阴性对照10%确定为抗原阳性表达。抗7

TM

[11]

原跨系列表达异常指骨髓细胞上同时表达不同系列抗原。

统计学处理󰀁采用SPSS11.5统计软件包,正态分布计量资料采用(x󰀂&s)表示,计量资料比较采用t检验,计数资料比较用󰀂2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结󰀁果

87例MDS患者的免疫表型分析显示,78例(90%)存在免疫表型异常,其中74例(85.1%)可见󰀂2个免疫表型异常,平均异常免疫表型数量为3.7,见表1。

表1󰀁MDS常见异常免疫表型分布(%)

成熟粒细胞群CD13/CD16分化异常幼稚细胞群CD45表达异常成熟粒细胞群跨系列表达CD38

幼稚细胞群CD34+CD11b+跨阶段表达异常幼稚细胞群跨系列表达CD7

成熟粒细胞群CD15/CD11b分化异常成熟粒细胞群SSC减低幼稚细胞群CD33表达缺失成熟粒细胞群CD10表达缺失成熟粒细胞群跨系列表达CD56单核细胞群跨系列表达CD56

41.334.529.924.114.913.711.511.510.38.08.0

󰀁󰀁异常免疫表型不仅存在于幼稚细胞群60例(70.0%),也存在于成熟粒细胞群71例(81.6%)和单核细胞群34例(39.1%),而且,随着患者骨髓幼稚细胞比例增高,异常免疫表型数量也逐渐增多,见表2。讨󰀁论

本研究FCM免疫分型检测都采用了CD45/SSC的设门策略,原理是CD45表达于所有血细胞表面且在不同细胞表达强度各有不同[12],淋巴细胞>单核细胞>成熟粒细胞>有核红细胞,在不同系列CD45表达随着细胞分化成熟不断增强,浆细胞不表达CD45。SSC在成熟粒细胞最大,单核细胞次之,淋巴细胞最小。因此,在CD45/SSC散点图上可以明确显示出4到5个细胞群体。CD45/SSC设门较传统的FSC/SSC设门可以更明确的显示各个细胞群,检测异常表型的特异性更高。但是CD45/SSC中幼稚细胞群位置不仅有原始粒细胞,还有嗜碱细胞(CD13+CD33+CD11b+CD10-CD117-HLA-DR-)、NK细胞(CD2+CD7+CD56+)、B内科急危重症杂志󰀁2009年󰀁第15卷󰀁第5期

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表2󰀁异常免疫表型在高危MDS和低危MDS中分布

异常免疫表型

平均异常免疫表型数(范围)幼稚细胞群󰀁CD34+CD11b+󰀁CD7+CD13+󰀁CD45异常󰀁CD33表达缺失成熟粒细胞群

󰀁CD38+CD11b+CD13+󰀁HLA-DR+CD11b+󰀁CD13/CD16分化异常󰀁CD15/CD11b分化异常󰀁CD10表达缺失󰀁SSC异常

15131711513

42.837.148.631.414.337.1

11423247

21.27.744.23.87.713.5

0.0100.690.001

1210176

34.328.8.617.1

92134

17.33.8257.7

0.0230.070

骨髓原始粒细胞󰀂5%(n=35)

n6

%2~18

骨髓原始粒细胞<5%(n=52)

n3.1

%0~8

P值0.000

祖细胞(CD19+CD10+CD34部分+)、幼稚单核细胞(CD+HLA-DR+CD14-),分析细胞异常表型时需要考虑这部分细胞影响,应结合其它抗体综合分析。

本研究在CD45/SSC的基础上选用了CD34、CD38、CD117、CD13、CD16、CD14等抗体进行分析。本研究中大部分MDS患者流式细胞术检查幼稚细胞群计数与形态学检查原始细胞计数是相符合的,高危MDS流式细胞术平均幼稚细胞群计数为12.85%,低危MDS的为2.12%,但是也有部分MDS患者的流式细胞术检查幼稚细胞计数高于或低于其细胞形态学检查原始细胞计数,考虑与MDS细胞形态病态影响形态学原始细胞计数相关。而流式细胞术检查通过客观分析MDS细胞的免疫表型,有助于对形态上不易鉴别的这部分原始细胞进行定量定性分析。

本研究中抗原跨阶段表达是MDS病例中最常见的异常表型,其中幼稚细胞群CD34+CD11b+异常最为常见,总的阳性率约24.1%,在高危MDS较低危MDS常见。MDS幼稚细胞群的其它抗原跨阶段表达还包括CD34+CD14+(4.6%)和CD34+CD15+(2.3%)。Ogata报道幼稚细胞群跨阶段表达CD15提示低危MDS,本研究中有2例RAEB患者CD34+CD15+表达,其它亚型MDS幼稚细胞群未见CD15表达,可能与Ogata等[3]报道中所采用的是富集原始细胞的方法与本文方法不同有关。

本研究中MDS患者骨髓可见成熟粒细胞群和单核细胞群部分细胞异常表达早期抗原标记,考虑[3]

这是由于MDS细胞病态,细胞的CD45/SSC发生改变,导致存在跨阶段表达的异常幼稚细胞混杂出现在CD45/SSC图中成熟粒细胞或单核细胞群的位置。依据细胞形态学检查鉴别这部分异常的早期细胞存在困难,而流式细胞学检查根据异常细胞免疫表型可将其从成熟细胞群中鉴别出来,有助于MDS的诊断和评估。本研究中成熟细胞表达早期标记最常见抗体组合为CD38+CD11b+CD13+,总的阳性率为29.9%,但CD38异常表达在高危MDS和低危MDS两组间比较无统计学差异(P=0.053)。其它异常表达还包括成熟粒细胞群和单核细胞群表达CD34(8%和8%)、成熟粒细胞表达HLA󰀁DR(19.5%)、成熟粒细胞表达CD117(6.9%),其中成熟粒细胞群异常表达HLA󰀁DR更多见于高危MDS。成熟粒细胞群CD34和CD117异常表达也更多见于高危MDS,但是由于病例数较少,有待进一步总结。

本研究中MDS跨系列异常表达中可见髓系细胞表达CD7、CD5、CD56淋巴标记抗原,总的阳性率为16.2%,非MDS血细胞减少患者未见跨系列表达异常报道。跨系列表达异常中最常见的为幼稚细胞群CD7表达,正常骨髓中多能造血干细胞也可以表达CD7,但是表达强度较低且数量很少。本研究中高危MDS中幼稚细胞群跨系列表达CD7阳性率为28.6%,要明显高于低危MDS(3.8%),但是病例数较少未带入统计中。Ogata[3]报道MDS中CD7跨系列表达提示预后差,结合本研究结果考虑可能与CD7跨系列表达更多见于骨髓原始细胞增高的高危MDS相关。有报道MDS中成熟粒细胞244

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[13]

群CD56跨系列表达较常见,阳性率可达15%,但些中间表现各家判断不一,这需要进一步研究统一标准予以评价。MDS的抗原分化异常还包括CD15/CD11b(13.7%)、CD13/HLA󰀁DR(5%)分化异常,其中CD15/CD11b抗原分化异常在高危MDS患者(31.4%)中的阳性率要高于低危MDS(3.8%)。

总之,我们的研究结果表明,细胞免疫表型异常在MDS中很常见(90%),选用多量的单克隆抗体并进行合适的组合,多数MDS患者可以找到免疫表型异常,且有相当一部分患者可以检测到2种或更多的异常免疫表型(85.1%)。多参数流式细胞术免疫表型分析有助于MDS的诊断和预后判断。

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(2009󰀁04󰀁27收稿󰀁2009󰀁06󰀁22修回)

本研究中阳性率仅为8%,可能与标本量少有关,有

待进一步总结。

抗原表达缺失极易受各种因素的影响,包括FCM的条件设定、标本处理方法和不同的荧光标记等,而且一些抗原表达受外界影响因素多在个体间差异较大。为了减少实验误差,我们严格统一标本处理方法,每次检测前先用标准微球调节仪器设定以统一检测条件,并在检测时尽量选用内参减少误差。例如,CD33通常表达于粒细胞和单核细胞,在单核细胞、原始粒细胞、早幼粒和中幼粒中表达最强,在中幼粒细胞以下阶段表达减弱或消失,但是有报道运用PE荧光素标记CD33可以增强CD33在中幼粒以下阶段细胞的表达,所以CD33表达受荧光素影响较大,在分析粒细胞CD33荧光强度时宜采用单核细胞上CD33表达作为内参,即CD33粒系细胞群中低表达不应归为异常,而CD33在粒细胞上表达缺失在单核细胞上有表达考虑为异常。Fujimoto报道CD表达在粒细胞分化过程中可见于原始粒细胞到晚幼粒阶段而不应见于杆状核和分叶核,在一些老年人、接受G-CSF治疗等状态下可以弱表达于成熟粒细胞。Stetler󰀁Stevenson[2]报道CD在成熟粒细胞上表达缺失可见于2/3的MDS患者。所以目前CD在成熟粒细胞表达缺失是否为异常表型尚有争议,我们也观察到CD在成熟粒细胞群中表达变化较大,故本研究中CD在成熟粒细胞上表达缺失未归为异常。

本研究中MDS抗原表达缺失异常包括成熟粒细胞群CD10、CD33表达缺失,幼稚细胞群CD33、CD13、HLA󰀁DR表达缺失,单核细胞HLA󰀁DR、CD13、CD14等表达缺失,但在RAEB和骨髓原始细胞<5%MDS中的分布无统计学差异(P>0.05)。

Stetler󰀁Stevenson发现CD13/CD16分化异常在MDS中很常见(70%),而DeniseA.Wells[5]报道异常阳性率为23%,本研究异常阳性率为41.3%。阳性率不同考虑与各家判断标准不同有关,Stetler󰀁Stevenson主要依据异常细胞比例进行判断,而DeniseAWells更关注细胞分化趋势,也有报道应用CD16MFI进行判断。我们的标准同DeniseA.Wells主要依据细胞分化趋势同时也注意到CD16+/CD16-细胞数量比例。细胞分化异常可以很直观的反映细胞免疫表型异常,目前研究对于典型的细胞分化异常都可以确认,但是对于一[2]

[14]