国际检验医学杂志２０１２年３月第３３卷第６期ｌｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｍａｒｃｈ ！ ：塑！ ・６４５・ ・基础实验研究论著・ 生物素标记探针一液相杂交一非变性ＰＡＧＥ检测非编码 小ＲＮＡ方法的建立和优化 郭跃辉 ，刘立宾 ，徐芒华 ，郭竹英 ，姜 斌 ，李 伟。，高丰厚 （１．上海交通大学医学院附属第三人民医院实验中心，上海２０１９００；２．浙江省医学遗传学重点实验室／ 检验医学省部共建教育部重点实验室／温州医学院检验医学院与生命科学学院，浙江温州３２５０３５） 摘方法要：目的 建立生物素标记探针一液相杂交一非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）检测非编码小ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）的方法。 将生物素标记的ｓＲＮＡ Ｕ６寡核苷酸探针经非变性ＰＡＧＥ电泳后转印至尼龙膜上，然后用辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）耦联链 将Ｂｉｏｔｉｎ一１１－ｄＵＴＰ成功标记至寡核苷酸上，随着寡核苷酸浓度 霉亲和素进行检测。从细胞中提取总ＲＮＡ，用已标记Ｕ６探针优化液相杂交退火条件及杂交缓冲液；用建立的方法检测并计算 ＢＥＡＳ－２Ｂ、Ａ５４９细胞中ｓＲＮＡ Ｕ６与ｍｉＲＮＡ１４５的含量。结果增加，检测信号强度越强，１０￣ｍｏｌ／Ｌ时达到最强。采用水浴反应条件与采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）仪梯次降温反应条件下得到的 杂化链无明显差异；以磷酸盐缓冲液作为杂交缓冲液优于Ｔｒｉｓ—ＨＣ１、ＤＥＰＣ水；ＢＥＡＳ－２Ｂ、Ａ５４９细胞５ ｐ－ｇ ＲＮＡ中Ｕ６含量接近； ＢＥＡＳ－２Ｂ细胞中ｍｉＲＮＡ１４５绝对含量高于Ａ５４９细胞。结论 成功建立并优化了ｓＲＮＡ检测新方法，为简单、易行、可靠地检测 ｓＲＮＡ提供了可能。 关键词：非编码小ＲＮＡ； 生物素化探针； 液相杂交； 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１２．０６．００３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３—４１３０（２０１２）０６—０６４５—０３ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｂｙ ｂｉｏｔｉｎ－ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｏｂｅ－ｌｉｑｕｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ｎｏｎ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ Ｇｕｏ Ｙｕｅｈｕｉ ，Ｌｉｕ Ｌｉｂｉｎ ，Ｘ“Ｍａｎｇｈｕａ ，Ｇｕｏ Ｚｈｕｙｉｎｇ ，Ｊｉａｎｇ Ｂｉｎ ，Ｌｉ肌 ，Ｇａｏ Ｆｅｎｇｈｏｕ （１＿Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｐｅｏｐｌｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ ｔｏ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１９００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｅｎｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗｅｎｚｈｏｕ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３２５０３５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）ｂｙ ｂｉｏｔｉｎ－ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｏｂｅ－ｌｉｑｕｉｄ ｈｙｂｒｉｄ— ｉｚａｔｉｏｎ－ｎｏｎ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ｓＲＮＡ Ｕ６ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｎｏｎ—ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ，ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｔｏ ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）一ｃｏｎｉｕ— ｇａｔｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ．Ｕ６ ａｎｄ ｍｉＲＮＡ一１４５ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ＢＥＡＳ－２Ｂ ａｎｄ Ａ５４９ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｅｓｔａｂ— ｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ Ｕ６ ｏｌｉｇｏｎｕｃ１ｅ０ｔｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ｂｉｏ一１１－ｄＵＴＰ，ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｓｉｇｎａｌ ａｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １０ ｂｔｍｏｌ／Ｌ．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｃｈａｉｎｓ，ａｃｑｕｉｒｅｄ ｂｙ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ ｏｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃ— ｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｗａｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１ ａｎｄ ＤＥＰＣ ｗａｔｅｒ．Ｕ６ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ＢＥＡＳ－２Ｂ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ Ａ５４９，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ｍｉＲＮＡ一１４５ ｉｎ ＢＥＡＳ－２Ｂ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ Ａ５４９．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓＲＮＡ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｏｆｆｅｒ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓＲＮＡ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ； ｂｉｏｔｉｎ－ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｏｂｅ；ｌｉｑｕｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ； ｎｏｎ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏ— ｐｈｏｒｅｓｉｓ 非编码小ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）是细胞中一大类由几十核苷酸到 几百核苷酸组成的、不编码蛋白质的ＲＮＡ，包括核小ＲＮＡ、核 仁ＲＮＡ、微小ＲＮＡ、干扰小ＲＮＡ、时序小ＲＮＡ等，其本身或 素，需特殊防护设备及相关专业人员，使其推广应用受到限 制＿５ ］。因此，有必要对Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹检测ｓＲＮＡ进行方法学 改良。本研究在传统Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹基础上发展了非同位素探 针、液相杂交、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）系统检测 ｓＲＮＡ技术。 与蛋白质结合形成复合体有重要生物学功能 ］。目前ｓＲＮＡ 检测技术主要有ＲＮＡ印迹（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹）、逆转录聚合酶链 反应（ｒｔ－ＰＣＲ）、微阵列芯片及测序技术。ｒｔ－ＰＣＲ、微阵列芯片 及测序技术与Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹相比，均需要特殊仪器设备，且检 １材料与方法 １．１仪器与试剂Ｔｒｉｚｏｌ试剂（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），生物素探针 测费用高昂Ｌ２ ］。传统Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹技术不仅可直接检出待 测ＲＮＡ，能明确ＲＮＡ碱基数目，同时也可进行半定量检测， 是检测ｓＲＮＡ不可取代的方法［５ ］。然而Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹检测 ｓＲＮＡ耗时长，步骤繁琐，技术要求较高，尤其是需使用同位 标记试剂盒、化学发光检测试剂盒（美国Ｐｉｅｒｃｅ），ＲＮＡ酶 （ＲＮａｓｅ）抑制剂（ＲＮａｓｅＺａｐ）、二乙基焦磷酰胺（ＤＥＰＣ）（美国 Ｓｉｇｍａ），１×ＰＣＲ反应液（大连宝生物），退火缓冲液（南通碧云 天），电泳仪、转印槽、普通ＰＣＲ仪（美国Ｂｉｏ—ｒａｄ）。人肺正常 ＊ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１１７２３２２）；上海市自然科学基金资助项ｌｉｌ（１１ＺＲ１４２１０００）｝上海交通大学医学院科技基金资助项 目（ＹＺ１０２７）。 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｆｅｎｇｈｏｕｇａｏ＠１６３．ｃｏｒｎ。 ・６４６・ 旦堕 验医学杂志２０１２年３月第３３卷第６期Ｉｎｔ Ｊ ＪｌｂＭｅｄ，Ｍａｒｃｈ ２０１２，Ｖｏ１．３３，Ｎｏ．６ 支气管上皮细胞株ＢＥＡＳ－２Ｂ、人肺癌细胞株Ａ５４９细胞购于上 海中科院细胞研究所。 １．２方法 １．２．１细胞培养 细胞株ＢＥＡＳ－２Ｂ、Ａ５４９在含１Ｏ 胎牛血 清、１００ ｕ／ｍＩ 青一链霉素的ＲＰＭＩ １６４０完全培养液内，３７℃、 ５ Ｃ（）ｚ饱和湿度培养箱内培养。细胞单层贴壁生长至７Ｏ ～ ８Ｏ 融合时，以０．２５ 胰蛋白酶消化、传代。 １．２．２总ＲＮＡ提取 使用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取细胞总ＲＮＡ， Ａ㈣ ／Ａｚｓｏ ＞１．８且２８Ｓ ｒＲＮＡ／１８Ｓ ｒＲＮＡ＞２用于后续 试验。 １．２．３寡核苷酸探针合成与标记ｈｓａ—ｍｉＲ一１４５探针序列： ５ Ｉ＿ＡＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＣ～３ 和ｈｓａ—Ｕ６探针序 列：５ＬＡＴＴＴＧＣＧＴＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＣＧ－３ ，由上海生工有限公 司合成。按ＤＮＡ ３ 末端生物素标记试剂盒说明书进行寡核酸 标记。 １．２．４核酸、探针液相杂交及检测取总ＲＮＡ ５，ｕｇ、探针２ Ｌ混匀，用１×ＰＣＲ反应液补充体积至１６ Ｉ 。不同退火条件 下进行杂交。ＰＣＲ仪反应条件为：９５℃２ ｍｉｎ；每９０ Ｓ降低 １℃，直至４２℃；４２℃６Ｏ ｍｉｎ。水浴反应条件为：９５℃２ ｍｉｎ， ４２℃３ ｈ。采用水浴退火方式，以不同杂交缓冲液进行杂交。 ４种不同杂交缓冲液包括：磷酸盐缓冲液、ｌ×ＰＣＲ反应液 （Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ缓冲液，以ＤＥＰＣ水配制）、退火缓冲液（Ｔｒｉｓ—ＨＣ１ 缓冲液，以ＤＥＰＣ水配制）和ＤＥＰＣ水。将杂交后的样品加入 ４ Ｉ 上样缓冲液，非变性ＰＡＧＥ分离核酸后，转移至尼龙膜 上，紫外线强度１．５ Ｊ条件下交联照射；４２℃干燥１０ ｍｉｎ， ４２℃封闭３０ ｍｉｎ；加入辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记链亲和霉 素（稀释比例为１：３００），４２℃处理４５ ｍｉｎ；洗涤缓冲液洗涤４ 次，每次５ ｍｉｎ；底物平衡缓冲液５ ｍＬ，洗涤５ ｒａｉｎ；化学发光检 测试剂盒检测发光的核酸条带。 １．２．５ ｓＲＮＡ表达量的计算 反应体系中，已知总探针量且 总探针足量时，理论上总探针量为与ｓＲＮＡ杂交的探针量和 未杂交的探针量相加之和，故与ｓＲＮＡ杂交结合的探针量计 算公式为：与ｓＲＮＡ杂交结合的探针量一总探针量×［与ｓＲ— ＮＡ杂交的探针量／（与ｓＲＮＡ杂交的探针量＋未杂交的探针 量）］。由于探针与目的ｓＲＮＡ完全碱基互补配对，故与ｓＲＮＡ 结合杂交的探针量即为ｓＲＮＡ含量。根据图像处理分析得到 的各条带灰度值，可计算ｓＲＮＡ含量：ｓＲＮＡ含量一生物素标 记探针总量×［杂化双链条带灰度值／（杂化双链条带灰度值十 未杂交探针条带灰度值）］。 １．３统计学处理所有试验均重复３次，计量资料以 ±５表 示，采用ＳＰＳＳ１１．５统计学软件进行均数配对ｔ检验，以Ｐ＜ ０．０５为差异有统计学意义。 ２结 果 ２．１ 生物素标记探针非变性ＰＡＧＥ检测 以浓度分别为１、 ２、５、１０“ｍｏｌ／Ｉ 寡核苷酸探针，采用末端转移酶于３ 端标记生 物素，各取等量已标记探针，经ｌ５ 非变性ＰＡＧＥ、转膜后检 测ＨＲＰ，结果如图１所示。探针浓度为１、２、５、１０／ｌｍｏｌ／Ｌ时， 均可在探针末端成功标记生物素，在浓度为１０／ｍｌｏｌ／Ｌ时，探 针信号达到最强，说明探针标记成功。 ２．２ 液相杂交后非变性ＰＡＧＥ检测系统的建立 以Ｕ６为 例，总ＲＮＡ、Ｕ６探针在液体环境下充分杂交后，非变性ＰＡＧＥ 检测。只加入Ｕ６探针时，仅在２Ｏ核苷酸（ｎｔ）处显示条带；杂 交条带出现在探针条带上方，过量探针条带在约２０ ｎｔ处。结 果见图２。 ２．３不同条件下的液相杂交反应 以ＰＣＲ仪及水浴条件进 行杂交，并对杂交产物进行检测，结果见图３。不同的液相杂 交条件均能使探针和目的ＲＮＡ杂交，形成杂化链。 标记物 １∞ｆ，Ｌ ２ ｍＩ／Ｌ ５ ｕｍｌ／Ｌ ｔ０ ．Ｉｌ。Ｉ／Ｌ 嘲 图１ 非变性聚丙烯酰胺胶电泳一转膜一交联固定一加 ＨＲＰ后检测生物素标记Ｕ６探针 标记物 总ＲＮＡ＋Ｕ６探针 单ｕ６探针 祭爻蓉赣 ６０ ｎｔ ２０ ｎｔ 图２ 液相杂交一非变性ＰＡＧＥ检测系统建立 ２．４不同缓冲液体系中的液相杂交反应 水浴条件下，采用 ４种不同缓冲液进行杂交，杂交产物检测结果见图４。采用４ 种杂交缓冲液均可形成目的杂化链，其中磷酸盐缓冲液、退火 缓冲液形成的杂化链更为明显。采用４种杂交缓冲液均可形 成非特异杂化链，但磷酸盐缓冲液形成的非特异性杂化链最少 （仅１条）。 标记镪 ｌａｎｅｌ Ｉａｎｅ２ Ｉａｎｅ３ Ｉａｎｅ４ ｌａｎｅ５ Ｕ６ 懒 鹕 Ｉｊｌ障ｉ榭■ ＿嘲■ ２ｏ 一 ■ ｌａｎｅｌ：５／ｔｇ总ＲＮＡ＋２ ｐｍｏｌ Ｕ６探针；ｌａｎｅ２：５ ｂｔｇ总ＲＮＡ＋５ ｐｍｏｌ Ｕ６探针；ｌａｎｅ３：５ ｇ总ＲＮＡ＋２ ｐｍｏｌ Ｕ６探针；ｌａｎｅ４：５ ｇ总 ＲＮＡ＋５ ｐｍｏｌ Ｕ６探针；ｌａｎｅ５：Ｕ６探针２ ｐｍｏｌ；ｌａｎｅｌ、ｌａｎｅ２退火条件： 在ＰＣＲ仪上设置逐步降温，先９５℃、２ ｍｉｎ，然后每９０ Ｓ降低１℃，直 至温度达到４２℃；４２℃维持６０ ｒａｉｎ。ｌａｎｅ３、ｌａｎｅ４退火条件９５℃水浴 ２ ｍｉｎ，然后嚣于４２℃，３ ｈ。 图３ 液相杂交不同退火条件的比较 标志物 ＾ ８ ｃ Ｄ 单Ｕ６探针 ＿一簟 Ａ：磷酸盐缓冲液；Ｂ：１×ＰＣＲ反应液（Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ缓冲液）；Ｃ：退火 缓冲液（Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ缓冲液）；Ｄ；ＤＥＰＣ水。 图４ 液相杂交不同杂交缓冲液的比较 标记物ＢＥＡＳ－２Ｂ＾５４Ｓ ＢＥＡＳ－２Ｂ Ａ５４９ Ｕ６ ｍｉＲＮＡ－１４５ Ｕ６ ｍｌＲＮＡ－１４５ －一－ ４ＩＩＩＰＷ 沸 ・ —＿－．－——＿● 图５ ＢＥＡＳ－２Ｂ与Ａ５４９细胞Ｕ６、ＭｉＲＮＡ１４５的表达量 ２．５ ＢＥＡＳ－２Ｂ与Ａ５４９细胞Ｕ６、ｍｉＲＮＡ一１４５表达量检测与 比较分别取ＢＥＡＳ一２Ｂ与Ａ５４９细胞总ＲＮＡ各５／ｔｇ，在磷酸 盐缓冲液中加入Ｕ６与ｍｉＲＮＡ一１４５探针２ Ｌ（含探针５ ｐｍｏ１），水浴条件下退火杂交，非变性ＰＡＧＥ电泳检测Ｕ６与 国际检验医学杂志２０１２年３月第３３卷第６期０１２，Ｖｏ１．３３，Ｎｏ．６ Ｉｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｍａｒｃｈ Ｚ・６４７・ ｍｉＲＮＡ１４５含量（见图５）。在ＢＥＡＳ－２Ｂ与Ａ５４９细胞中均可 检出Ｕ６、ｍｉＲ－１４５。采用图像处理分析软件计算图５各条带灰 量为（２．５９±０．０３）和（２．８２土０．０４）ｐｒｎｏｌ；在５ ｇ Ａ５４９细胞 总ＲＮＡ中，Ｕ６、ｍｉＲ－１４５含量为（２．６６±０．４４）和（２．２８－－＋ 度值（见表１）。根据ｓＲＮＡ含量计算公式计算ｍｉＲ－１４５、Ｕ６表 达量。在５ ｇ ＢＥＡＳ－２Ｂ细胞总ＲＮＡ中，Ｕ６、ｍｉＲＮＡ一１４５含 表１ ０．０３）ｐｍｏｌ。ｍｉＲＮＡ１４５／Ｕ６比值在ＢＥＡＳ－２Ｂ、Ａ５４９细胞分别 是１．０８、０．８５，差异具有统计学意义（￡一４６．７７，Ｐ＜０．０５）。 根据图５计算的条带灰度值（互±ｓ） ３讨 论 Ｒｅｖ Ｍｅｄ，２００９，６０（１）：１６７－Ｉ７９． 生物体内存在的大量ｓＲＮＡ组成了细胞中高度复杂的 ＲＮＡ网络，对细胞增殖、周期、分化和凋亡等进行。 因此，有必要建立快速、简单、可靠的ｓＲＮＡ检测方法。本研 究所建立检测方法的主要流程为：生物素标记探针一液相杂 交一非变性ＰＡＧＥ电泳一转印至尼龙膜一ＨＲＰ耦联链霉亲 和素检测。 Ｅ２］Ｔａｎｇ Ｆ，Ｈａｊｋｏｖａ Ｐ，Ｂａｒｔｏｎ ＳＣ，ｅｔ ａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉ— ｌｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｗｈｏｌｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００６—０１—２４［２０１２－０１—１４］，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ１３５１３７４／？ｔｏｏｌ＝ｐｕｂｍｅｄ． ［３］Ｃｈｅｎ Ｃ，Ｒｉｄｚｏｎ ＤＡ，Ｂｒｏｍｅｒ ＡＪ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｂｙ ｓｔｅｍ—ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲ［Ｊ／ＯＬ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２００５—１１－．２７［２０１２－０１—１４］，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｐｍｉｄ／１６３１４３０９／？ｔｏｏｌ＝ｐｕｂｍｅｄ． 采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹技术检测非编码ＲＮＡ的原理是用已 标记的寡核苷酸探针检测与寡核苷酸探针互补的未知ＲＮＡ。 寡核苷酸探针可根据需要选择性合成，因此探针的标记是实现 检测目的的关键 由于同位素标记法存在局限，具有较高敏感 性及稳定性的生物素一亲和素系统得到广泛应用 ］。本研究通 过末端转移酶将Ｂｉｏｔｉｎ－１１一ｄＵＴＰ成功连接至合成的寡核苷酸 ［４］Ｃａｓｔｏｌｄｉ Ｍ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ，Ｂｅｎｅｓ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｒｒａｙ ｆｏｒ ｍｉ— ｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ｍｉＣｈｉｐ）ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＬＮＡ）［刀．ＲＮＡ，２００６，１２（５）：９１３—９２０． ［５］Ｓｔｒｉｔ Ｓ，Ｍｉｃｈａｌｉｓｋ ＣＷ，Ｅｒｋａｎ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ３ 末端，且随着寡核苷酸浓度增加，检测信号强度越强，１Ｏ ／ｌｍｏｌ／Ｌ时达到最强，说明标记体系最好选用浓度为１０￣ｍｏｌ／Ｌ 的寡核苷酸。 ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２００９，４（１）：３７—４３． ［６］李善清，唐万兵，孙鹏，等．全反式视磺酸及干扰素对胃癌细胞系 ＭＮＫ４５中ｐ１６，ｐ２１，ｃＭｙｃ基因表达的影响［Ｊ］．国际检验医学杂 志，２０１１；３２（２）：１５９—１６２． 传统Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹固相杂交反应过程繁琐，耗时费力，且 ＲＮａｓｅ无处不在，进行多步操作增加了ｓＲＮＡ被降解的可 能［５ ］。液相杂交使杂交反应在溶液里完成，简化了步骤，缩短 了时间，增加了特异性和敏感性［ｇ 。因此，本研究选择将探 ［７］Ｔｒａｎ Ｎ．Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｏｔｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏ— ｇｙ，２００９，２（１）：１－３． Ｅ８］Ｄｕａｎ Ｚ，Ｃｈｏｙ Ｅ，Ｎｉｅｌｓｅｎ ＧＰ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏＲ— ＮＡｓ ｉｎ ｃｈｏｒｄｏｍａ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｍｉＲＮＡ一１ ｉｎ Ｍｅｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 针与待杂交样品置于不同杂交缓冲液中，采用不同退火条件， 探索ｓＲＮＡ最佳检测条件。结果显示液相杂交检测ｓＲＮＡ无 需特殊试剂及仪器，采用磷酸盐缓冲液及水浴条件即可进行杂 交反应。 ［Ｊ］．Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ，２０１０，２８（６）：７４６—７５２． ［９］Ｗａｎｇ Ｘ，Ｔｏｎｇ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｓ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｍｉＲ— ＮＡｓ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒＩｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｅｉ，２０１０，１ １（９）： ３１３８－３１４８． 生物素标记寡核苷酸探针稳定性较高，如在液相杂交体系 中加入准确定量的寡核苷酸探针，便可根据最终的灰度值计算 样品中的ｓＲＮＡ含量。本研究证实５ ｇ肺支气管上皮细胞 ［１Ｏ］Ｙａｎ Ｆ，ｗｕ Ｘ。Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ＤＮＡ， ＲＮＡ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏ— ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，５２（４）： ２８１－２８６． ＢＥＡＳ－２Ｂ与肺癌细胞Ａ５４９总ＲＮＡ中，Ｕ６绝对含量相近（ 一 １．５，Ｐ一０．２７）；ｍｉＲＮＡ１４５在ＢＥＡＳ－２细胞中的含量高于 Ａ５４９。说明本研究所建立的方法可用于ｓＲＮＡ的定量检测， 甚至可直接检测目的ＲＮＡ，且无需设置内参。 综上所述，本研究在传统Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹基础上建立并优 化了检测ｓＲＮＡ的新方法，为简单、易行、可靠地检测ｓＲＮＡ ［１１］徐卫，李建勇，陆凤翔．液相杂交检测Ｂ细胞淋巴瘤细胞系ｍｉＲ一 ２８的表达［Ｊ］．中国实验血液学杂志，２００６，１４（２）：２８９—２９２． ［１２］Ｃｈａｍｎｏｎｇｐｏｌ Ｓ，Ｍａｒｏｎｅｙ ＰＡ，Ｎｉｌｓｅｎ Ｔｗ．Ａ ｒａｐｉｄ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｕ— ｓｉｎｇ ｓｐｌｉｎｔｅｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１０，６６７（１）：３－１７． （收稿日期：２０１１－１２－１８） 提供了可能，也为ｓＲＮＡ基础及临床研究提供了有力地保障。 参考文献 Ｅｉ］Ｇａｒｚｏｎ Ｒ，Ｃａｌｉｎ ＧＡ，Ｃｒｏｃｅ ＣＭ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ａｎｎｕ （上接第６４４页） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｗ－ａｎｄ ｈｉｇｈ—ｄｏｓｅ ｌｕｌａｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ，２００１，１９（４）：７０９—７１５． ［１２］韩锐．抗癌药物研究与实验技术［Ｍ］．北京：北京医科大学、中国 协和医科大合出版社，１９９７：２７１． ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ，２００６，１６（１）：１４１—１４６． ［１１］Ｔｅｒａｏｋａ Ｈ，Ｓａｗａｄａ Ｔ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｙ，ｅｔ ａ１．ＴＧＦ－ｂｅｔａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌ— （收稿日期：２０１Ｉ－１２－１９）
